一、培養基pH調節試劑的介紹

  依據於《GB 4789.28 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》、《中華人民共和國藥典》等標準的質量控製，不同培養基具有不同的pH質控範圍。對於調節培養基pH所使用的試劑，一般使用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸，除此之外，調高pH常用的試劑還有碳酸鈉和碳酸氫鈉。

  在大多數人的認知裏，使用氫氧化鈉溶液調培養基pH，滅菌後pH會下降，使用碳酸鈉溶液調pH，滅菌後pH變化不明顯，使用碳酸氫鈉溶液調pH，滅菌後pH會上升。其中特別是氫氧化鈉，培養基滅菌後pH下降的現象歸因於氫氧化鈉本身，而實際情況可能並非如此。

  為分析培養基滅菌後pH變化的具體原因，示例分析了TSA、SDA、mcpc培養基，為更直觀的表示滅菌後pH的變化，對含酸堿指示劑的支原體肉湯進行了詳細分析。

二、培養基滅菌前後pH變化的原因分析

  為還原試驗人員最真實的培養基滅菌情況，試驗不使用成品培養基，分別配製了TSA（參照藥典）、SDA（參照藥典）、mcpc培養基（去除纖維二糖），其中TSA分別使用不同腖類配製，標記為TSA-1~TSA-5。使用氫氧化鈉調節pH後滅菌，滅菌前後pH如表1所示。

表1 多款培養基滅菌前後pH的比較

  由表1可知，使用氫氧化鈉調節培養基pH，滅菌後pH不一定下降，甚至還有pH上升的培養基（TSA-1和TSA-4），由此可見，氫氧化鈉不一定是導致培養基pH變化的原因，可能是其它成分引起的，例如pH下降最明顯的SDA，該培養基含大量的葡萄糖，葡萄糖經121℃高壓滅菌後，葡萄糖首先脫水形成5-羥甲基糠醛，5-羥甲基糠醛再分解為乙酰丙酸和乙酸，這一過程中有酸性物質生成，會導致溶液的pH降低，同時形成了一種有色物質而產生褐變。為進一步分析這一原因，對含有酸堿指示劑的支原體肉湯進行滅菌前後的pH分析。

  首先，分別使用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節支原體肉湯的pH，滅菌前後pH的變化情況如表2所示。

表2 分別使用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節支原體肉湯pH

  如表2所示，使用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節pH的支原體肉湯滅菌後pH分別下降、變化不明顯、上升。培養基的顏色變化如圖1所示，無論使用何種試劑調節pH，滅菌後支原體肉湯的顏色均變深，這可能也是與葡萄糖的反應有關。

圖1 葡萄糖褐變使培養基顏色加深

  為驗證以上結論，對不調pH的支原體肉湯進行滅菌，對剔除葡萄糖的支原體肉湯分別使用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調pH後滅菌，滅菌前後pH的變化情況如表3所示。

表3 不含葡萄糖支原體肉湯滅菌前後pH變化情況

  由表3可知，對於剔除葡萄糖的支原體肉湯，使用氫氧化鈉調節pH滅菌後pH保持不變，而含有葡萄糖不調pH的支原體肉湯滅菌後pH下降了0.46，這一數值與表2中支原體肉湯（使用氫氧化鈉調pH）pH下降了0.49的數值基本一致。這說明氫氧化鈉經高壓滅菌後pH保持穩定，支原體肉湯pH下降是由葡萄糖引起來的。

  由表3還可知，碳酸鈉、碳酸氫鈉經高壓滅菌後pH均上升，碳酸氫鈉相比碳酸鈉經高壓滅菌水解程度更高，因此pH上升幅度更大。由於剔除了葡萄糖，培養基不會再受葡萄糖反應的影響，由此培養基不會產生褐變，如圖2所示。

圖2 剔除葡萄糖的支原體肉湯滅菌後不會變褐

  值得一提的是，無論使用氫氧化鈉，還是碳酸鈉、碳酸氫鈉調節pH，支原體肉湯隻要含有葡萄糖，均會產生一定的褐變現象，如圖3所示，這有礙於陽性管與陰性管的對比度，影響試驗結果的觀察，更重要的是，葡萄糖作為肺炎支原體的主要營養，會極大的影響肺炎支原體的生長。

圖3 支原體肉湯滅菌後是否含葡萄糖的顏色比較

三、降低培養基褐變的方法

  已知，支原體肉湯經不同操作人員滅菌後，培養基褐變程度不一，使用落地式滅菌鍋相比手提式滅菌鍋褐變程度要高，這是由於落地式滅菌鍋一般降壓更慢，由此滅菌時間相對更長。為驗證這一規律，對支原體肉湯進行滅菌，滅菌結束且壓力降至0時及時取出培養基為一組，不及時取出燜30分鍾後再取出培養基為第二組。為排除其它因素的影響，首先對不含葡萄糖的支原體肉湯進行這一試驗。

  不含葡萄糖的支原體肉湯，經氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節pH後滅菌，不同滅菌時間pH的變化如表4所示。

表4 不含葡萄糖支原體肉湯不同滅菌時間的pH變化

  由表4可知，支原體肉湯不含葡萄糖時，滅菌結束後，無論滅菌時間多少，pH無明顯變化。說明不含葡萄糖情況下，滅菌時間對pH無影響，這一規律同時滿足氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節pH的支原體肉湯。培養基的顏色變化如圖4所示，不含葡萄糖的支原體肉湯未產生褐變現象。

圖4 不含葡萄糖的支原體肉湯滅菌時間對培養基顏色無影響

（注：“燜鍋”為培養基滅菌結束後不取出，使培養基繼續停留在滅菌鍋中）

  排除其它因素的幹擾後，對含葡萄糖的支原體進行相同操作滅菌，滅菌前後的pH如表5所示。

表5 含葡萄糖支原體肉湯不同滅菌時間的pH變化

  由表5可知，含葡萄糖的支原體肉湯延長滅菌時間後，使用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉調節pH的支原體肉湯pH的變化分別為pH下降程度提高、pH由上升轉變為下降、pH上升程度降低，此外，不調pH的支原體肉湯pH下降的程度也提高了，說明延長滅菌時間會延長葡萄糖的反應時間，使支原體肉湯的pH持續下降。為降低支原體肉湯的褐變程度，滅菌結束後及時取出培養基是有效的方法。培養基的顏色變化圖如圖5所示。

圖5 含葡萄糖的支原體肉湯滅菌時間對培養基顏色有影響

  由圖5可知，使用碳酸氫鈉調節pH的支原體肉湯褐變程度最高，這是由於葡萄糖在高pH時反應速率更快，說明滅菌時不適宜將pH調至過高。

四、總結

  1.pH調節試劑不是引起培養基滅菌前後pH變化的主要原因，葡萄糖經高壓滅菌反應是引起培養基pH下降以及褐變的主要原因。

  2.為降低含糖培養基褐變的程度，滅菌結束後及時取出培養基是有效的方法，此外，由於葡萄糖在高pH情況下反應速率更快，因此滅菌時不適宜將pH調至過高。

五、注意事項

  培養基滅菌的注意事項可參考文章《培養基滅菌後顏色變深的原因探究及預防措施》點擊查看。

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