一、背景介紹

  在中國藥典中，對於藥品中梭菌檢驗的分離培養使用的是哥倫比亞瓊脂，而在進行方法驗證時，則使用質控菌株生孢梭菌對培養基的靈敏度進行測試。然而，許多人在培養生孢梭菌時候發現，用硫乙醇酸鹽流體培養基可以比較容易的成功培養生孢梭菌，但用哥倫比亞瓊脂經常培養不成功，也會遇到有時候成功有時候失敗，或者計數少很多，結果不穩定，有時候懷疑是不是培養基有問題，結果買來中檢院的對照培養基使用也是相同的結果，有時候做出來遠不如TSA平板計數多，也懷疑過厭氧環境的問題，在此，我們對可能出現的原因進行了多方麵的測試和分析。

二、培養失敗原因及細節操作分析

  1.培養基除氧。

  這個是我們發現導致培養失敗的最主要原因。通過對哥倫比亞瓊脂平板的多次測試，培養不成功的主要原因就是配製好的哥倫比亞瓊脂平板在正常的空氣環境中存放，氧氣會逐漸滲入到平板中，在接種生孢梭菌後會對生孢梭菌產生毒害作用，導致生長數量偏少或者不生長。且平板在空氣中放置時間越長，效果會越差，短期存放會導致計數結果明顯偏少，長時間存放則會導致生孢梭菌幾乎不生長。

  因此，在哥倫比亞平板使用之前，將平板放置於厭氧環境中靜置24h左右，使平板中的氧氣充分逸出，此時再使用時生孢梭菌就可以生長的很好了。除氧可以采用厭氧包處理，也可以將平板放在厭氧培養箱、氮氣箱等環境中均可達到理想效果，以下是我們測試的部分實驗數據：

  實驗數據可以看出，長時間放置的哥倫比亞平板如果未除氧，接種＜100CFU的生孢梭菌都不生長，除氧使用後的哥倫比亞平板回收率明顯高了許多，甚至超過了未除氧TSA平板的計數結果（經過多次測試，如果將TSA與哥倫比亞都除氧後再進行準確計數對比，生孢梭菌生長數量是差不多的，但TSA受氧氣影響較小，製備好的TSA平板即使存放在空氣中很長時間不進行除氧操作，接種生孢梭菌依然可以較好的生長，TSA除氧後的回收率提升不大，這一點與哥倫比亞平板明顯不同，其他品牌的TSA目前未進行測試），因此哥倫比亞瓊脂平板除氧這一步操作對實驗的成功至關重要。

  2.操作時間的影響

  理想狀態下，對於生孢梭菌這類絕對厭氧菌的操作應當完全在厭氧箱內操作是最好的，可以很大程度上避免厭氧菌的死亡。但由於許多實驗室並不具備厭氧操作的條件，因此隻能在正常環境中操作，而生孢梭菌暴露在空氣中是極容易死亡的（上述驗證試驗為最大程度確保試驗的數據的準確性，菌種稀釋、取出培養基、塗布操作到放入厭氧環境內培養，整個流程不超過10min），所以進行操作中必須動作要快，盡可能的減少培養基和生孢梭菌在空氣中暴露的時間，更容易成功。

  3.稀釋液的選擇

  0.1%蛋白腖水、pH7.0氯化鈉蛋白腖緩衝液理論上是優於生理鹽水的，特別是操作慢的時候，生孢梭菌在生理鹽水中更容易死亡，但在快速操作的時候，稀釋液的影響不大。

  4.平皿的透氣性

  由於接種後的平板要置於厭氧環境培養，平皿的蓋子必須要確保透氣性良好，可以與厭氧環境中的氣體流動交換，嚴禁纏封口膜等會導致平皿密閉的操作。

  5.平板的水汽

  在使用小型的厭氧罐、厭氧盒或厭氧培養袋等裝置時，由於環境密閉，培養過程中水汽不會散出去，會在內部形成水汽，若在平皿蓋子上形成大量水汽，有時候會導致蓋子與底皿緊密貼合，平皿內氣體不流通，培養失敗。因此在做試驗前，務必做好充分準備，可先將哥倫比亞平板預先在超淨工作台中開蓋吹15-30min去除表麵水汽進行適當的幹燥處理，再將平皿除氧24h後直接使用。

  6.厭氧環境

  厭氧環境對生孢梭菌的生長時至關重要的，可以采用厭氧培養箱，或者使用厭氧罐、厭氧盒、厭氧培養袋等裝置，密切監視裝置內的環境狀況（可使用氧氣指示劑進行監測），確保厭氧環境沒有問題。

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