一、簡介
革蘭氏染色（Gram Staining）是用來鑒別細菌的一種方法：這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學性質不同，可將細菌分成兩類，即革蘭氏陽性（Gram Positive）與革蘭氏陰性（Gram Negative）。
有關革蘭氏染色的方法、原理、操作步驟和實驗現象，本公司網站都有很詳細的介紹，具體請參考：/microknowsear.asp?keyword=%B8%EF%C0%BC%CA%CF%C8%BE%C9%AB
但經常有試驗人員做出的結果出現各種異常，同種菌體不同的人染出的結果不一樣，同一個人使用同樣的染色液，每次染出的結果也不完全相同。針對這些問題，本文就該實驗過程中的注意事項做出較為全麵的整理，以期對廣大實驗人員有所幫助。
二、影響因素
（1）試劑的質量
首先應該保證我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期後的廢棄處理都應有嚴格規定，確保試劑有效。
A、結晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。
B、碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
C、酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95%，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脫去，最後呈紅色。但當酒精濃度不同時，它的脫色能力也可能有所差異。
為了保證試劑的統一有效性，建議使用商品化的成套試劑。我公司革蘭氏染色成套試劑貨號為：HB8278，其性能及相關資料可參閱：/asphtml/product374.htm。
（2）菌株
A、培養基的成分 有資料顯示革蘭陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的複合物，它與碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脫色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的複合物結合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。所以盡量選擇在一般營養瓊脂上純化培養的菌株進行染色。
B、菌齡 細菌的典型形態、染色性是在對數生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
C、塗片 塗片時，挑取菌體後應該在無菌水上塗成薄薄的菌膜。若是菌體堆積太厚，往往菌體之間變得毫無縫隙，而造成脫色效果不佳，容易產生假陽性的結果，極大影響染色結果的準確性。因此在塗片過程一定要將菌膜塗得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。同時，在初染、媒染及複染的過程中，應將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。
（3）溫度
固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態結構。固定方法是將幹燥後的細菌塗片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的人員將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發生變化，影響了染色的結果。
另外菌體固定後，如果載玻片的溫度還沒完全降下來，就直接用結晶紫初染，也會造成革蘭氏陰性菌顏色偏深，誤判成假陽性（如圖1）。
圖1 載玻片不同溫度時進行結晶紫初染的試驗結果差異
（左：未完全冷卻，藍紫色 右：完全冷卻，紅色）
（4）時間
A、染色時間 結晶紫初染和碘液媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。時間過長，結晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控製在40 s-60 s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過60 s準確率會有一定的降低，若媒染超過100 s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間。
B、脫色時間 陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時間條件下的結果，如果延長脫色時間，也會使脫色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脫去顏色，最後染上複紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時間太短又會使陰性菌染上的結晶紫不能完全脫色，出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。
洗脫時間應當嚴格控製在20 s-30 s之間，同時保證洗脫效果，如果操作過程中，洗脫了30 s，還有紫色物質流出，那麽應該根據實際情況繼續衝洗，直至不再流出紫色物質為止。應根據季節、氣溫調整染色和脫色時間，一般冬季時間可稍微長些，夏季可稍微短些”。
（5）對照的設置
大腸杆菌和枯草芽孢杆菌的革蘭氏陰性和陽性特征已經被廣泛研究，因此可以用作標準對照菌株，在革蘭氏染色實驗中進行結果驗證。
在用革蘭氏染色方法鑒定一個未知菌株時，采用大腸杆菌和枯草芽孢杆菌這兩種已知的對照菌株同時染色對比，能夠保證革蘭氏染色實驗的準確性和可重複性，也可以根據情況選用大腸杆菌和金黃色葡萄球菌作為對照。總之，對於不經常進行本實驗的操作人員，每次設置對照同時進行染色操作尤為必要。
三、注意事項
綜上所述，試劑的質量、培養基的組成、菌齡、直接的染色操作等，都能影響細菌的染色，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。所以我們在染色時要注意當染色結果與預想的結果出現不一致時，要充分考慮到這些因素的影響。同時試驗操作時，養成良好的學習態度，嚴格按照操作規程來做，提高實驗結果的準確性。
在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控製的幾個方麵：染色菌必須是在其活躍期內，塗布狀態不可太厚，嚴格控製初染、媒染時間和脫色時間，並保證洗脫效果。為了更準確判斷試驗結果，應該分別設置陽性對照和陰性對照菌，與待鑒定菌種同時進行染色，對比觀察試驗結果。
相關產品：
注:本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。
上一篇：GB4789.4-2024食品中沙門氏菌檢驗新版標準更改詳解
下一篇：沒有了！
