人肺炎支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體固體平板法及染色鏡檢

劉浩然
錄入時間:2024-1-24 10:30:52 來源：青島betway必威西汉姆联生物

一、支原體簡介

支原體結構簡單，缺乏細胞壁，僅有質膜，胞體內有核蛋白體以及一個由環形雙鏈DNA分子組成的原核。支原體大小僅有0.1μm~0.3μm，最小直徑約為100nm，可通過細菌濾器，會幹擾細胞培養等工作的進行。由於其能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。

不同支原體利用的能源物質不同，如肺炎支原體、人型支原體等可發酵葡萄糖，口腔支原體可水解精氨酸，還有解脲支原體可利用尿素作為能源。我們可通過發酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。

支原體營養要求一般比細菌高，除必須的基礎營養物質外，還需添加10%~20%的動物血清以提供支原體所需的助生長因子。由於大多數的支原體兼性厭氧，有些菌株在活化分離時保持5%~10%二氧化碳環境生長狀態更好。解脲支原體在厭氧條件下生長更好。

支原體無細胞壁，對滲透壓敏感，對抑製細胞壁合成的抗生素不敏感，因此可添加青黴素抑製細菌的生長。由於滲透壓突變會導致支原體破裂死亡，因此培養支原體時，維持適宜的滲透壓顯得格外重要。此外，在支原體培養中，pH也是重要因素。

支原體在固體平板培養基上的菌落狀態為煎蛋狀，這種菌落狀態也是因為支原體沒有細胞壁的緣故，支原體向培養基內部生長形成“蛋黃”部分，支原體在培養基表麵生長便形成了“蛋清”部分。

二、肺炎支原體、口腔支原體檢驗依據及原理

人肺炎支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現，要求使用支原體肉湯培養基（貨號為HB7025-2，可參考文章支原體肉湯培養基的原理和使用方法）培養監測肺炎支原體。具體操作要求為：將肺炎支原體稀釋至10^-7~10^-9，接種在支原體肉湯培養基中，每個稀釋度接種3支試管，置於36℃培養7-14天，觀察培養基變色結果。肺炎支原體可以發酵培養基中的葡萄糖，使培養基的pH值降低，遇指示劑酚紅使培養基變黃。

豬肺炎支原體檢查的方法在中國藥典中無具體要求，我們可以參照人肺炎支原體檢查法。

口腔支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現，要求使用精氨酸支原體肉湯培養基（貨號為HB7025-5）培養監測口腔支原體。具體操作要求為：將口腔支原體稀釋至10^-3~10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基中，每個稀釋度接種3支試管，置於36℃培養7-14天，觀察培養基變色結果。口腔支原體可以利用培養基中的精氨酸，使培養基pH值升高，遇指示劑酚紅使培養基變紅。

三、支原體固體平板培養的方法

1.取活化的人肺炎支原體（活化支原體的方法可參照視頻：肺炎支原體的靈敏度試驗方法）、豬肺炎支原體分別接種至支原體肉湯中，並進行10倍梯度稀釋，塗布適宜濃度的稀釋液100μL至支原體瓊脂固體平板上（貨號為HB7025-3），封口膜包住平板邊緣以提供微需氧環境且能有效避免一定的汙染，直到培養至光線下可以看到針尖大小的菌落，人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態如圖1所示。

圖1 人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態

豬肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態如圖2所示。

圖2 人肺炎支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態

2.取活化的口腔支原體接種至精氨酸支原體肉湯中，並進行10倍梯度稀釋，塗布適宜濃度的稀釋液100μL至支原體瓊脂固體平板上（使用貨號為HB7025-1；較HB7025-3不同點在於含精氨酸和酚紅），封口膜包住平板邊緣以提供微需氧環境且能有效避免一定的汙染，直到培養至光線下可以看到針尖大小的菌落，口腔支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態如圖3所示。

圖3 口腔支原體在平板上及鏡檢下的菌落狀態

四、支原體染色方法及染色後鏡檢結果

為了增加顏色的對比度，更好的觀察檢測支原體，可采用加染色液的方法對支原體進行染色，染色還可有效排除氣泡的幹擾。中國藥典采用的為指示細胞培養法即DNA染色法，需要借助特殊的熒光染料和熒光顯微鏡進行觀察。而一般的實驗室並不具備這樣的條件，因此可以使用更為簡單的染色方法，借助兩種常用的染料及普通電子顯微鏡即可觀察。具體步驟為：將蕃紅染液或結晶紫染液（革蘭氏染色A液；HB8278）稀釋一定的倍數，直接加入到平板上染色10秒，之後用水衝洗掉，無需切割瓊脂塊，直接將平板放置於顯微鏡觀察，人肺炎支原體的染色鏡檢結果如圖4所示。