1. 分析目標化合物
土黴素，金黴素，四環素
2. 儀器設備
帶熒光檢測器的高效液相色譜儀。
3．試劑
除下列試劑外，使用附錄2所列試劑。
咪唑：特級
咪唑緩衝溶液：將68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸鎂溶解在800mL水中，用乙酸調節pH7.2後，加水至1,000mL。
含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液：第1液：將21.0g檸檬酸溶解在水中至1,000mL。第2液：將71.6g磷酸氫二鈉溶解在水中至1,000mL。在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg)：在內徑8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色譜用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分離特性的物質。
4．標準品
鹽酸土黴素：本品1.000mg 含有土黴素0.850mg以上效價，分解點為190℃～194℃。
鹽酸金黴素：本品1.000mg含有鹽酸金黴素0.900mg以上效價，分解點為210℃以上。
鹽酸四環素：本品1.000mg 含有鹽酸四環素0.900mg以上效力，分解點為214℃以上。
5．試驗溶液的製備
a 提取方法
①肌肉、肝髒和腎髒
肌肉：盡可能除去脂肪層，攪碎混合均勻後，稱取其5.00g。
肝髒和腎髒：攪碎混合均勻後，稱取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，攪拌1分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，水層移入100mL分液漏鬥中。離心分離管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，用振蕩器激烈振蕩1分鍾後，按上述同樣條件離心分離，合並水層於上述分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，分取水層。
② 脂肪
脂肪：盡可能除去肌肉層，攪碎混合均勻後，稱取其20.0g。
加入200mL正己烷，攪拌1分鍾後，加入40mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，再攪拌1分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，分取水層。正己烷層中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，用振蕩器激烈振蕩1分鍾後，按上述同樣條件離心分離，分取水層，合並於先分取的水層中。
③ 奶
稱取5.00g樣品，加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液和20mL正己烷，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，分取水層。
④ 蛋
除去蛋殼，充分均勻後，稱取其5.00g。加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，均勻後，加入100mL正己烷，攪拌1分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，水層移入100mL分液漏鬥中。離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，用振蕩器激烈振蕩1分鍾後，按上述同樣條件離心分離，合並水層於分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器振蕩5分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，分取水層。
⑤ 魚貝類
有殼貝類：除去殼，攪碎混合均勻後，稱取其5.00g。
其它的魚貝類：攪碎混合均勻後，稱取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，攪拌1分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，水層移入100mL分液漏鬥中。離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液，用振蕩器激烈振蕩1分鍾後，按上述同樣條件離心分離，合並水層於分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，以每分鍾3000轉離心分離10分鍾，分取水層。
b 淨化方法
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中，順次注入10mL甲醇、10mL水和5mL飽和EDTA溶液，棄去流出液。柱中注入a提取方法所得的溶液後，注入10mL水，棄去流出液。注入10mL甲醇，收集流出液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去甲醇。殘留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氫鉀溶液溶解，此為試驗溶液。
6．操作方法
a 定性試驗
按下列操作條件進行試驗，試驗結果必須與標準品的一致。
操作條件
柱填充劑：十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm)。
柱：內徑4.0～6.0mm，長150mm不鏽鋼管。
柱溫： 40℃
檢測器：激發波長380nm，發射波長520nm。
流動相：土黴素和四環素試驗時，用咪唑緩衝溶液：甲醇(17：3)的混合溶液。調整流速使土黴素約5分鍾流出。
金黴素試驗時，用咪唑緩衝溶液：甲醇(3：1)的混合溶液。調整流速使金黴素約7分鍾流出。
b 定量試驗
根據與a 定性試驗相同操作條件所得的試驗結果，峰高法或峰麵積法定量。
7．定量限
a 肌肉，肝髒，腎髒，奶，蛋和魚貝類
土黴素：0.02 mg/kg
金黴素：0.03 mg/kg
四環素：0.02 mg/kg
b 脂肪
土黴素：0.005 mg/kg
8．注意事項
(1) 試驗溶液的製備
① 離心分離溫度保持在室溫。
② 抽濾後濾液混濁時，濾液再次進行離心分離。
③ 在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色譜中，注入試驗溶液後，30mL水分數次加入效果較好地洗浄柱中殘留的乙二胺四乙酸。
(2) 標準溶液的配製
①稱取相當於10.0mg土黴素的標準品，溶解在甲醇中至10mL，作為土黴素的標準原液（土黴素1,000mg（效價）／L，1,000mg／L）。本標準原液保存在-20℃，1年內穩定。
②稱取相當於10.0mg金黴素的標準品，溶解在甲醇中至10mL，作為金黴素的標準原液（金黴素1,076mg（效價）／L，1,000mg／L）。本標準原液保存在-20℃，1年內穩定。
③稱取相當於10.0mg四環素的標準品，溶解在甲醇中至10mL，作為四環素的標準原液（四環素1,082mg（效力）／L，1,000mg／L）。本標準原液保存在-20℃，1年內穩定。
④用1.36%磷酸二氫鉀溶液將土黴素，金黴素和四環素各標準原液遞減稀釋，作為製作標準曲線用的標準溶液。
(3) 其它
①同時進行很多樣品試驗的篩選試驗法提高判斷効率時，用「○土黴素，金黴素和四環素的篩選法（參照117 頁）」判斷為陽性的，不妨用本檢測方法實施試驗。
②使用本檢測方法檢出土黴素，金黴素和四環素時，最好用帶質量檢測器的高效液相色譜儀確證。
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