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營養缺陷互補法篩選



錄入時間:2023-10-18 15:41:58 來源:青島betway必威西汉姆联生物

若宿主細胞屬於某一營養缺陷型,則在培養這種細胞時的培養基中必須加入該營養物質後,細胞才能生長。如果重組後進入這種細胞的外源DNA中除了含有目的基因外再插入一個能表達該營養物質的基因,就實現了營養缺陷互補,使得重組細胞具有完整的代謝能力,培養基中即使不加該營養物質也能生長。如宿主細胞有的缺少亮氨酸合成酶基因,有的缺少色氨酸合成酶基因,通過選擇性培養基,就能將重組子從宿主細胞中篩選出來。這種篩選方法就稱為營養缺陷互補法。

  β-半乳糖苷酶顯色反應就是一種利用宿主細胞和重組細胞中β-半乳糖苷酶活性有無,表現出營養缺陷互補,從而能以直觀的顯色檢測方法進行重組子篩選的常用方法。若pUC 質粒載體含有β-半乳糖苷酶基因(lac Z')的調節片段,具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯β-半乳糖苷酶(z),如果這個細胞帶有未插入目的DNA的pUC19質粒,當培養基中含有 IPTG時,lac I的產物就不能與lac Z'的啟動子區域結合,因此,質粒的lac Z'就可以轉錄和翻譯,產生的lac Z蛋白會與染色體DNA編碼的一個蛋白形成具有活性的雜合β-半乳糖苷酶,當有底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal)存在時,x-gal會被雜合的β-半乳糖苷酶水解形成藍色的產物,即那些帶有未插入外源DNA片段的pUC19質粒的菌落呈藍色。如果pUC19質粒中插入了目的DNA片段,就破壞了lac Z'的結構,導致細胞無法產生功能性的Lac Z蛋白,也就無法形成雜合β-半乳糖苷酶,因而菌落是白色的。據此可以根據菌落的顏色,篩選出含目的基因的重組體。這一方法大大簡化了在這種質粒載體中鑒定重組體的工作。

 

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