1 主題內容與適用範圍
本標準規定了空腸彎曲菌的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中空腸彎曲菌的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3.1 溫箱：42±1C。
3.2 厭氧罐：帶有雙相壓力表。
3.3 氣袋法。
3.4 無菌平皿。
3.5 滅菌吸管。
3.6 相差顯微鏡。
3.7 三角瓶。
3.8 玻片染色缸或染色盤。
3.9 載玻片。
3.10 液氮罐。
3.11 厚壁毛細管。
3.12 水浴器：25±1℃，37±1℃和42±1℃各一台。
3.13 酒精燈。
3.14 滅菌試管。
3.15 接種針。
3.16 試管架。
4 培養基和試劑
4.1 蛋白腖水：按GB 4789.28中3.13規定。
4.2 Cary-Blair氏運送培養基：按GB 4789.28中4.52規定。
4.3 改良Camp-BAP培養基：按GB 4789.28中4.53規定。
4.4 Skirrow氏培養基：按GB 4789.28中4.54規定。
4.5 氧化酶試劑：按GB 4789.28中3.18規定。
4.6 3%過氧化氫液：按GB 4789.28中3.20規定。
4.7 1%甘氨酸培養基：按GB 4789.28中4.56規定。
4.8 30μg蒙啶酸圓形濾紙片。
4.9 三糖鐵培養基：按GB 4789.28中4.26規定。
4.10 革蘭氏染色液：按GB 4789.28中2.2規定。
4.11 TTC瓊脂：按GB 4789.28中4.55規定。
4.12 馬尿酸鈉培養基：按GB 4789.28中3.9規定。
4.13 三氯化鐵：按GB 4789.28中3.9規定。
4.14 快速硫化氫(H2S)試驗瓊脂：按GB 4789.28中4.50規定。
4.15 DNA酶甲基綠瓊脂：按GB 4789.28中4.51規定。
5 檢驗程序
空腸彎曲菌檢驗程序如下：
（圖略）
6 操作步驟
6.1 樣品的采集及處理
不論那種食物樣品都應盡快交付檢驗。如果樣品必須運送和保存，應當使用Cary－Blair半固體培養基。彎曲菌的存活時間取決於溫度，在25℃情況下，其存活時間不到24h或更少，因此樣品在原始分離前需放冰箱或冷處保存。
6.2 微需氧條件的製備
最佳微需氧條件是氧氣為5%、二氧化碳為10%、氮氣為85%。
6.2.1 帶有雙相壓力計(可表示正負壓的)的厭氧罐：在裝皿密封後，先抽去罐內空氣至負壓7.3×104Pa(550mmHg)處，輸入上述三種混合氣體使罐內壓力恢複於零；再將罐內氣體抽至負壓7.3×104Pa(550mmHg)，同樣輸入上述氣體至零，即可放置溫箱培養。
6.2.2 氣袋法：操作時隻使用氣體發生劑而不加催化劑。
6.2.3 雙平板法：取兩塊平板，一塊平板接種已知的兼性厭氧菌(如變形杆菌)，另一塊平板接種樣品，去掉皿蓋，將含瓊脂的兩隻皿相對合齊並用膠布粘封，放入密封不漏氣的罐內(或袋內)進行培養。由於兼性厭氧菌生長的代謝作用，可使小環境中的氧氣濃度下降和二氧化碳濃度上升。
6.2.4 蠟燭缸法
將已接種細菌的平板置於容量2000mL的磨口標本缸或幹燥器內。缸蓋及缸口塗以凡士林，放入小段點燃蠟燭於缸內(勿靠近缸壁，以免烤熱缸壁而炸裂)，蓋密缸蓋。缸內燃燭約於0.5～1min，因氧減少自行熄滅，此時容器內約含二氧化碳5%～10%。最後連同容器一並置於42±1℃溫箱中培養。
6.3 分離培養
6.3.1 拭子或液體可直接在選擇性培養基如改良Camp－BAP布氏杆菌培養基或使用skirrow氏培養基平板上劃線接種。於42℃培養48h後，觀察可疑菌落。
6.3.2 第一型菌落不溶血，灰色、扁平、濕潤、有光澤，看上去像水滴，有從接種線向外擴散的傾向；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為1～2mm)，邊緣完整、發亮。
6.4 初步鑒定
將可疑菌落做氧化酶和過氧化氫酶試驗，如為陽性，則塗片做革蘭氏染色。本菌為革蘭氏陰性菌，大小為0.3～0.4μm×1.5～3μm，呈S形、螺旋狀或紡錘形。在固體培養基上培養時間過久或在不適條件下則常呈現球形菌。在暗視野或相差顯微鏡下觀察，動力明顯。根據菌落生長特征、菌體染色、動力、氧化酶和過氧化氫酶試驗陽性者，可初步確定為彎曲菌。
6.5 確定鑒定
經初步鑒定後，仍需做下述試驗(以下各項試驗均需在5%氧氣的微需氧環境中培養)。
6.5.1 甘氨酸(glycine)耐受性試驗：接種於甘氨酸培養基中，培養48h，如為陽性，在培養基表麵有雲霧狀生長，則為彎曲菌空腸亞種。
6.5.2 硫化氫生長試驗：接種於TSI斜麵上，並吊一根乙酸鉛濾紙條於管口，培養物經48～72h培養，空腸彎曲菌一般在斜麵上少量生長，其反應為堿性/堿性(K/K)，濾紙條變黑，但培養基底部不因硫化氫而變黑。
6.5.3 對3.5%氯化鈉的耐受性試驗：接種於3.5%含鹽肉湯培養基，經48h培養，空腸彎曲菌不生長。
6.5.4 42℃和25℃生長試驗：將培養物接種於兩管布氏杆菌肉湯中，一管放於42℃下，一管放於25℃下培養48h，42℃生長而25℃不生長者，則為空腸彎曲菌。
6.5.5 馬尿酸鈉水解試驗：將培養物接種於馬尿酸鈉培養基，於42℃培養48h，離心沉澱取出部分上清液。加入三氯化鐵試劑，如出現恒久沉澱物則為陽性，空腸彎曲菌呈陽性反應。
6.5.6 萘啶酸(Nalidixic acid)試驗：將可疑空腸彎曲菌塗布接種於血平板上，然後貼上含30μg萘啶酸的濾紙於平板上，空腸彎曲敏感而腸道彎曲菌不敏感。
6.5.7 TTC(2，3，5－氯化三苯四氮唑)試驗：空腸彎曲菌在TTC培養基上呈陽性，而胎兒彎曲菌為陰性，陽性者有紫色菌苔並有光澤。
6.5.8 硝酸鹽還原試驗：取培養物的濃菌懸液，在37℃放置2h，加入試劑，觀察顏色反應，空腸彎曲菌呈紅色的陽性反應。
6.5.9 彎曲菌的生化鑒別見表1。
表1 彎曲菌屬各個種的生化性狀
（圖略）
6.6 生物分型
6.6.1 快速馬尿酸鈉水解試驗：將細菌接種在1%馬尿酸鈉0.4mL，37℃水浴2h，再加丙酮與丁酮溶液的3.5%茚三酮0.2mL，徐徐加入避免相混，放置10min後觀察結果。深紫色為陽性，淡紫色或無色為陰性。
6.6.2 快速硫化氫(H2S)試驗：取一環細菌懸浮於快速硫化氫半固體瓊脂上1/3段，37℃水浴2h，觀察結果，細菌團塊周圍變黑為陽性。
6.6.3 D NA酶水解試驗：細菌點種於DNA酶甲基綠瓊脂平板上，微需氧環境培養3～5d，菌苔周圍出現無色透明環為陽性。生物分型結果見表2。
6.7 血清分型：空腸彎曲菌O因子分型應采用間接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。
表2 空腸彎曲菌等的生物分型
（圖略）
6.8 菌種保存
空腸彎曲菌菌種應接種在改良Camp－BAP斜麵培養基上(棉塞不宜過緊)，於42℃～43℃微需氧中培養48h後，置4℃冰箱微需氧內可保存10～14d，需要時仍可轉種一次，長期保存用凍幹法。
6.9 對空腸彎曲菌檢驗時，應嚴格執行無菌操作，防止自身感染。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由中國進出口商品檢驗技術研究所負責起草。
本標準主要起草人孟洪德。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。
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