一、革蘭氏染色法
（一）原理：
用於生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長於中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性複紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性複紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱複合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是隻用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的複合物易於滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅複染後就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。
（二）方法：
1.以酒精擦拭玻片，在酒精燈上幹燥後，用接種環挑取一環滅菌的去離子水或生理鹽水到載玻片上，挑取少量純培養物在水滴上塗抺至均勻分散，將塗片在酒精燈火焰上滅活、固定。
2.滴加結晶紫染色液1-2滴，染1分鍾，用去離子水輕輕水洗。
3.待幹，滴加革蘭氏碘液，作用1分鍾，用去離子水輕輕水洗。
4.滴洗脫色劑（95%酒精），不時搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約10～20秒），用去離子水輕輕水洗。
5.待幹，滴加沙黃複染液，複染30秒。用去離子輕輕水洗，待玻片幹燥後鏡檢。
6.油鏡鏡檢。菌體呈紫色者為革蘭氏陽性菌；呈紅色者為革蘭氏陰性菌。
（三）注意事項
1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受塗片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。
2.染色過程中勿使染色液幹涸。用水衝洗後，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。
3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由於菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。
二、細菌芽孢染色法
（一）原理
細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法隻能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據芽胞既難以染色而一旦染上色後又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基於同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，然後水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然後用對比度強的染料對菌體複染，使菌體和芽胞呈現出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便於觀察。
（二）方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）製備菌液：加1-2滴無菌水於小試管中，用接種環從斜麵上挑取2-3環的菌體於試管中並充分打勻，製成濃稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2-3滴於小試管中，用接種環攪拌使染料與菌液充分混合。
（3）加熱：將此試管浸於沸水浴（燒杯），加熱15-20min。
（4）塗片：用接種環從試管底部挑數環菌液於潔淨的載玻片上，做成塗麵，晾幹。
（5）固定：將塗片通過酒精燈火焰3次。
（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
（7）複染：加蕃紅水溶液染色5min後，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸幹。
（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最後用油鏡觀察。結果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。
2.Schaeffer與Fulton氏染色法
（1）塗片：按常規方法將待檢細菌製成一薄的塗片。
（2）晾幹固定：待塗片晾幹後在酒精燈火焰上通過2-3次。
（3）染色：
① 加染色液：加5%孔雀綠水溶液於塗片處（染料以鋪滿塗片為度），然後將塗片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時開始計算時間，約維持15-20min。加熱過程中要隨時添加染色液，切勿讓標本幹涸。（加熱時溫度不能太高）。
② 水洗：待玻片冷卻後 ，用水輕輕地衝洗，直至流出的水中無染色液為止。
③ 複染：用蕃紅液染色5min。
（4）水洗、晾幹或吸幹。
（5）鏡檢：先低倍，再高倍，最後在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態。結果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。
（三）注意事項
1.供芽胞染色用的菌種應控製菌齡。
2.改良法在節約染料、簡化操作及提高標本質量等方麵都較常規塗片法優越，可優先使用。
3.用改良法時，欲得到好的塗片，首先要製備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時，應先用接種環充分攪拌，然後再挑取菌液，否則菌體沉於管底，塗片時菌體太少。
三、細菌的莢膜染色法
（一）原理：
由於莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染莢膜，即設法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由於莢膜的含水量在90%以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
（二）方法
推薦以下四種染色法，其中以濕墨水方法較簡便，並且適用於各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。
1.負染色法：
（1）製片：取潔淨的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻並塗布。
（2）幹燥：將塗片放在空氣中晾幹或用電吹風冷風吹幹。
（3）染色：在塗麵上加複紅染色液染色2-3min。
（4）水洗：用水洗去複紅染液。
（5）幹燥：將染色片放空氣中晾幹或用電吹風冷風吹幹。
（6）塗黑素：在染色塗麵左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然後向右一拖，使黑素在染色塗麵上成為一薄層，並迅速風幹。
（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。結果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。
2.濕墨水法
（1）製菌液：加1滴墨水於潔淨的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。
（2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片於混合液上，然後在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多餘的菌液。
（3）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。
結果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現一明亮的透明圈即為莢膜。
3.幹墨水法
（1）製菌液：加1滴6%葡萄糖液於潔淨載玻片一端，挑少量膠質芽胞杆菌與其充分混合，再加1環墨水，充分混勻。
（2）片：左手執玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然後以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。
（3）幹燥：空氣中自然幹燥。
（4）固定：用甲醇浸沒塗片，固定1 min，立即傾去甲醇。
（5）幹燥：在酒精燈上方，用文火幹燥。
（6）染色：用甲基紫染1-2min。
（7）水洗：用自來水輕洗，自然幹燥。
（8）鏡檢：先用低倍鏡再高倍鏡觀察。結果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
（1）塗片：按常規法塗片，可多挑些菌體與水充分混合，並將粘稠的菌液盡量塗開，但塗布的麵積不宜過大。
（2）幹燥：在空氣中自然幹燥。
（3）染色：用Tyler染色液染5-7min。
（4）脫色：用20%CuSO4水溶液洗去結晶紫，脫色要適度（衝洗2遍）。用吸水紙吸幹，並立即加1-2滴香柏油於塗片處，以防止CuSO4結晶的形成。
（5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢後注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。結果：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。
（四）注意事項
1.加蓋玻片時不可有氣泡，否則會影響觀察。
2.應用幹墨水法時，塗片要放在火焰較高處並用文火幹燥，不可使玻片發熱。
3.在采用Tyler法染色時，標本經染色後不可用水洗，必須用20%CuSO4衝洗
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