1 主題內容與適用範圍
本標準規定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3.1 離心機及離心管。
3.2 研缽及細沙。
3.3 溫箱：30℃，35℃，37℃。
3.4 顯微鏡。
3.5 厭氧培養裝置：常溫催化除氧式或焦性沒石子酸除氧式。
3.6 吸管：1mL，10mL。
3.7 注射器：1mL。
3.8 平皿。
3.9 接種環。
3.10 載玻片。
3.11 小白鼠。
4 培養基和試劑
4.1 庖肉培養基：GB 4789.28中4.67。
4.2 卵黃瓊脂培養基：GB 4789.28中4.68。
4.3 明膠磷酸鹽緩衝液：GB 4789.28中3.23。
4.4 肉毒分型抗毒診斷血清。
4.5 胰酶：活力1∶250。
4.6 革蘭氏染色液：GB 4789.28中2.2。
5 檢驗程序
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序如下：
（圖略）
注：①報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。
②報告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。
③報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。
如上所示，檢樣經均質處理後，及時接種培養，進行增菌、產毒，同時進行毒素檢測試驗。毒素檢測試驗結果可證明檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
對增菌產毒培養物，一方麵做一般的生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素的產生情況。所得結果可證明檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產毒培養物進行分離培養，對所得純菌株進行形態、培養特性等觀察及毒素檢測，其結果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。
6 操作步驟
6.1 肉毒毒素檢測
液狀檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明膠磷酸鹽緩衝液，浸泡、研碎，然後離心，取上清液進行檢測。
另取一部分上清液，調pH6.2，每9份加10%胰酶(活力1：250)水溶液1份，混勻，經常輕輕攪動，37℃作用60min，進行檢測。
肉毒毒素檢測以小白鼠腹腔注射法為標準方法。
6.1.1 檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2隻，每隻0.5mL，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射後24h內發病、死亡。主要症狀為豎毛，四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死於呼吸麻痹。
如遇小鼠猝死以至症狀不明顯時，則可將注射液做適當稀釋，重做試驗。
6.1.2 確證試驗：不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發病、死亡者，取樣分成3份進行試驗，1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min，1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射未經其他處理的混合液的小白鼠以特有症狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時要進行毒力測定及定型試驗。
6.1.3 毒力測定：取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩衝液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d。根據動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如：5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡，而注射5000倍稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000～10000MLD/mL。
6.1.4 定型試驗：按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩衝液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1000MLD/mL的範圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠2隻，每隻0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩衝液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護動物免於發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。
注：①未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
②為爭取時間盡快得出結果，毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
②根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。
④進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。
⑤試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。
6.2 肉毒梭菌檢出(增菌產毒培養試驗)
取庖肉培養基3支，煮沸10～15min，做如下處理：
第一支：急速冷卻，接種檢樣均質液1～2mL；
第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續於60℃保溫10min，急速冷卻；
第三支：接種檢樣，繼續煮沸加熱10min，急速冷卻。
以上接種物於30℃培養5d，若無生長，可再培養10d。培養到期，若有生長，取培養液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，方法同4.1，陽性結果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。
6.3 分離培養
選取經毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產毒培養物(必要時可重複一次適宜的加熱處理)接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養基表麵覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，但G型菌無此現象。
根據菌落形態及菌體形態挑取可疑菌落，接種庖肉培養基，於30℃培養5d，進行毒素檢測及培養特性檢查確證試驗。
6.3.1 毒素檢測：試驗方法同4.1。
6.3.2 培養特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養48h，觀察生長情況及菌落形態。肉毒梭菌隻有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長並形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。
注：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預溫37℃(流質蜂蜜)，或52～53℃(晶質蜂蜜)，充分攪拌後立即稱取20g，溶於100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉澱，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培養基(8～10mL)各1支，分別在30℃及37℃下厭?蹠嘌?d，按6.2進行肉毒毒素檢測。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由衛生部蘭州生物製品研究所負責起草。
本標準主要起草人王成懷。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。
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