1 方法來源
GB 4789.11-2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗β型溶血性鏈球菌檢驗》、DB46/T 280-2014《羅非魚鏈球菌病檢測技術規程》及文獻的方法。
2 適用範圍
本程序規定了淡水魚及其養殖環境中無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae的檢驗方法。
3 術語和定義
3.1 β型溶血
在菌落周圍形成完全透明的溶血環，紅細胞完全溶解。
3.2 β型溶血性鏈球菌
能夠產生β型溶血的化膿（或A群）鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和無乳（或B群）鏈球菌（Streptococcus agalactiae）。
4 培養基
4.1 改良胰蛋白腖大豆肉湯（Modified tryptone soybean broth, mTSB）：見附錄A中A.1。
4.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar)：見附錄A中A.2。
4.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)：見附錄A中A.3。
4.4 革蘭氏染色液：見附錄A中A.4。
4.5 胰蛋白腖大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB）：見附錄A中A.5。
4.6 草酸鉀血漿：見附錄A中A.6。
4.7 0.25％氯化鈣(CaCl2)溶液：見附錄A中A.7。
4.8 3％過氧化氫(H2O2)溶液：見附錄A中A.8。
第一法 無乳鏈球菌分離鑒定
本方法先檢測疑似β型溶血性鏈球菌，分離出的疑似β型溶血性鏈球菌菌株再根據生化檢測等進一步鑒定是否為無乳鏈球菌。
6 檢驗程序
無乳鏈球菌分離鑒定程序見圖1。
圖1 無乳鏈球菌分離鑒定程序
7 操作步驟
7.1 樣品的處理
魚樣品：魚麻醉後，將待檢魚樣放置於幹淨的解剖盤上，用75%酒精棉輕輕擦拭魚體表進行消毒。用無菌剪刀和鑷子取魚的肝、脾、腎混合為一份樣品，背部肌肉為另一份樣品，按無菌操作分別稱取檢樣25g，加入盛有225mL mTSB的均質袋中，用拍擊式均質器均質1min～2min；或加入盛有225mL mTSB的均質杯中，以8000r/min～10000r/min均質1min～2min。
水體樣品：混勻後取500mL，用0.22μm濾膜過濾，將濾膜重懸於20mL mTSB，混勻。
水底沉積物樣品：去除所有表層水後，混勻取25g，加入225mL mTSB，混勻。
7.2 增菌、分離
將製備好的樣品放置在36℃±1℃培養18h～24h。
將增菌液劃線接種於哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36℃±1℃18h～24h，觀察菌落形態。
β溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落形態為直徑約2mm～3mm，灰白色、表麵光滑突起、有乳光、圓形、邊緣整齊，並產生β溶血的菌落。注意部分菌株無β溶血環。
7.3 純培養
挑取5個（如小於5個則全選）可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培養18h～24h。
7.4 初步鑒定β型溶血性鏈球菌
7.4.1 革蘭氏染色鏡檢
挑取可疑菌落染色鏡檢。β型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。
7.4.2 觸酶試驗
挑取可疑菌落於潔淨的載玻片上，滴加適量3%過氧化氫（H2O2）溶液，立即產生氣泡者為陽性。β型溶血性鏈球菌觸酶試驗為陰性。
7.4.3 鏈激酶試驗（選做）
吸取草酸鉀血漿0.2mL於0.8mL滅菌生理鹽水中混勻，再加入經36℃±1℃培養18h～24h的可疑菌的TSB培養液0.5mL及0.25%氯化鈣（CaCl2）0.25mL，振蕩搖勻，置於36℃±1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內容物不流動）。繼續36℃±1℃培養24h，凝固塊重新完全溶解為陽性，不溶解為陰性，β型溶血性鏈球菌為陽性。
7.5 鑒定無乳鏈球菌
根據7.4結果符合β型溶血性鏈球菌特征的菌株可采用下列任一種方法進一步確定是否為無乳鏈球菌。
7.5.1 生化鑒定
采用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡，如API 20 STREP或VITEK鑒定卡進一步確定是否為無乳鏈球菌。
7.5.1.1 無乳鏈球菌部分生化試驗：觸酶試驗陰性，分解海藻糖，不分解山梨醇，馬尿酸鈉、CAMP和VP試驗均為陽性，七葉苷和6.5%NaCl試驗均為陰性。
7.5.1.2 無乳鏈球菌傳統生化鑒別要點：
1）本菌特征革蘭陽性球菌，菌落較小，β溶血環、觸酶試驗陰性，CAMP試驗陽性。
2）與其他溶血鏈球菌的鑒別
附錄A培養基和試劑
A.1 改良胰蛋白腖大豆肉湯培養基(Modified tryptone soybean broth, mTSB)
A.1.1 基礎培養基(胰蛋白腖大豆肉湯TSB)
A.1.1.1 成分
A.1.1.2 製法
胰蛋白腖
17.0g
大豆蛋白腖
3.0g
氯化鈉
5.0g
磷酸二氫鉀（無水）
2.5g
葡萄糖
2.5g
蒸餾水
1000.0mL
將A.1.1.1中各成分溶於蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌15min，備用。
A.1.2 抗生素溶液
A.1.2.1 多黏菌素溶液
稱取10mg多黏菌素B於10mL滅菌蒸餾水中，振搖混勻,充分溶解後過濾除菌。
A.1.2.2 萘啶酮酸鈉溶液
稱取10 mg萘啶酮酸於10mL 0.05mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖混勻,充分溶解後過濾除菌。
A.1.3 完全培養基
A.1.3.1 成分
A.1.3.2 製法
胰蛋白腖大豆肉湯(TSB)
1000.0mL
多黏菌素溶液
10.0mL
萘啶酮酸鈉溶液
10.0mL
無菌條件下，將A.1.3.1中各成分進行混合，充分混勻，分裝備用。
相關產品：
A.2 哥倫比亞CNA血瓊脂(Columbia CNA blood agar)
A.2.1 成分
A.2.2 製法
胰酪蛋白腖
12.0g
動物組織蛋白消化液
5.0g
酵母提取物
3.0g
牛肉提取物
3.0g
玉米澱粉
1.0g
氯化鈉
5.0g
瓊脂
13.5g
多黏菌素
0.01g
萘啶酸
0.01g
蒸餾水
1000.0mL
將A.2.1中各成分溶於蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121 ℃滅菌12min，待冷卻至50℃左右時加50mL；無菌脫纖維綿羊血，搖勻後倒平板。
相關產品：
A.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)
A.3.1 基礎培養基
A.3.1.1 成分
A.3.1.2 製法
動物組織酶解物
23.0g
澱粉
1.0g
氯化鈉
5.0g
瓊脂
8.0g～18.0g
蒸餾水
1000.0mL
將基礎培養基成分溶解於蒸餾水中，加熱促其溶解。121℃高壓滅菌15min。
A.3.2 無菌脫纖維綿羊血
無菌操作條件下，將綿羊血加入到盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約10min，靜置後除去附有血纖維的玻璃珠即可。
A.3.3 完全培養基
A.3.3.1 組分
A.3.3.2 製法
基礎培養基
1000.0mL
無菌脫纖維綿羊血
50.0mL
當基礎培養基的溫度為45℃左右時，無菌加入綿羊血，混勻。校正pH至7.2±0.2。傾注15mL於無菌平皿中，靜置至培養基凝固。使用前需預先幹燥平板。預先製備的平板未幹燥時在室溫放置不得超過4h，或在4℃冷藏不得超過7d。
相關產品：
A.4 革蘭氏染色液
A.4.1 結晶紫染色液基礎培養基
A.4.1.1 成分
A.4.1.2 製法
結晶紫
1.0g
95％乙醇
20.0mL
1％草酸銨水溶液
80.0mL
將結晶紫完全溶解於乙醇中，然後與草酸銨溶液混合。
A.4.2 革蘭氏碘液
A.4.2.1 成分
A.4.2.2 製法
碘
1.0g
碘化鉀
2.0g
蒸餾水
300.0mL
將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300mL。
A.4.3 沙黃複染液
A.4.3.1 成分
A.4.3.2 製法
沙黃
0.25g
95％乙醇
10.0mL
蒸餾水
90.0mL
將沙黃溶解於乙醇中，然後用蒸餾水稀釋。
A.4.4 染色操作步驟
將塗片在酒精燈火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95％乙醇脫色，約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加複染液，複染1min，水洗後進行幹燥，鏡檢。
相關產品：
A.5 胰蛋白腖大豆肉湯Tryptone soybean broth, TSB
A.5.1 成分
A.5.2 製法
胰蛋白腖
17.0g
氯化鈉
5.0g
大豆蛋白腖
3.0g
磷酸二氫鉀（無水）
2.5g
葡萄糖
2.5g
蒸餾水
1000.0mL
將A.5.1中各成分溶於蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃滅菌15min，分裝備用。
相關產品：
A.6 草酸鉀血漿
A.6.1 成分
A.6.2 製法
草酸鉀
0.01g
人血
5.0mL
草酸鉀0.01g放入滅菌小試管中，再加入5mL人血，混勻，經離心沉澱，吸取上清液即為草酸鉀血漿。
相關產品：
A.7 0.25％氯化鈣(CaCl2)溶液
A.7.1 成分
A.7.2 製法
氯化鈣（無水）
22.2g
蒸餾水
1000.0mL
稱取22.2g氯化鈣（無水）溶於蒸餾水中，分裝備用。
相關產品：
A.8 3％過氧化氫(H2O2)溶液
A.8.1 成分
A.8.2 製法
30％過氧化氫(H2O2)溶液
100.0mL
蒸餾水
900.0mL
吸取100mL 30％過氧化氫(H2O2)溶液，溶於蒸餾水中，混勻，分裝備用。
相關產品：
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