β-半乳糖苷酶是細菌利用乳糖的關鍵酶。細菌分解乳糖主要依靠兩種酶的作用，一種是β-半乳糖苷酶滲透酶，這種酶作用於細胞膜上，可以讓乳糖進入細胞，而另一種就是β-半乳糖苷酶，這種酶位於細胞內，使乳糖分解成半乳糖和葡萄糖。
同時具有上述兩種酶的細胞，可以在24-48h內發酵乳糖，同時缺乏上述兩種酶的細菌，不能分解乳糖。而部分細菌隻具有β-半乳糖苷酶（如宋內誌賀氏菌、亞利桑那沙門氏菌），而不具有β-半乳糖苷酶滲透酶，因此乳糖進入細胞很慢，宏觀表現則為遲緩發酵乳糖（通常需要3-7天）。在《GB4789.5-2012食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 誌賀氏菌檢驗》中，提供了兩種檢測細菌是否含有β-半乳糖苷酶的方法。
1. 液體法（ONPG法）
所有乳糖快速發酵和遲緩發酵的細菌，都可以快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。因而利用ONPG可以快速檢測遲緩發酵乳糖的菌株。
培養基成分：
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ONPG |
60.0mg |
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0.01mol/L磷酸鈉緩衝液（PH7.3-7.7） |
10.0ml |
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1%蛋白腖水（PH7.3-7.7） |
30.0ml |
製法：
將ONPG溶於緩衝液內，加入蛋白腖水，以過濾法除菌，分裝於10mm×75mm試管內，每管0.5mL，用橡皮塞塞緊。
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試驗方法：
挑取培養物一滿環接種，於36℃±1℃培養1h-3h和24h觀察結果。如果β-半乳糖苷酶產生，則於1h-3h變黃色，如無此酶則24h不變色。ONPG在固體培養基中分解後的顯色終產物會大麵積擴散，因此隻適用於液體培養基。
2. 平板法（X-Gal法）
利用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）作為顯色底物，如果細菌含有β-半乳糖苷酶，則分解顯色底物，平板上的培養物變藍色。如不含此酶，則菌落呈無色或不透明色。
培養基成分：
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蛋白腖 |
20.0g |
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氯化鈉 |
3.0g |
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5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal） |
200.0mg |
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瓊脂 |
15.0g |
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蒸餾水 |
1000.0ml |
製法：
將各成分加熱煮沸於1L蒸餾水中，冷卻至25℃左右校正pH至7.2±0.2,115℃高壓滅菌10min，傾注平板避光冷藏備用。
試驗方法：
挑取培養物接種於平板，劃線或點種皆可，於36℃±1℃培養18-24h觀察結果。如果有β-半乳糖苷酶產生，則平板上菌落呈藍色。如不含此酶，則菌落呈無色或不透明色。培養48h-72h後，有部分轉為淡粉色。
X-Gal在液體和固體裏中檢測β-半乳糖苷酶的活性比其他顯色或熒光底物更有效。
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