一、標準簡介
在飲用天然礦泉水檢驗方法（GB 8538）中，銅綠假單胞菌的檢驗一直是一個必檢項目。新版《GB 8538-2022 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》已於2022.6.30發布，2022.12.30正式實施。與舊版本相比，新版標準中，增加了對銅綠假單胞菌進一步確證相關的內容（如圖1），並對菌數計算方法做了相應調整。本文主要闡述這些增加的內容。
圖1 飲用天然礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗程序
二、綠膿菌素生長試驗
舊版標準《GB 8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》中，在CN瓊脂培養基上培養出的藍色或綠色菌落直接判為銅綠假單胞菌；但在新標準中，對於這種藍色或綠色菌落，需要通過綠膿菌素試驗進行確認，結果陽性（產綠膿菌素）者，方可判為銅綠假單胞菌。
有關綠膿菌素試驗，具體操作如下：
將在CN瓊脂上呈藍色或綠色菌落的純培養物分別接種在綠膿菌素測定培養基上，36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL～5mL，可搗碎培養基並充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解於三氯甲烷，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中，並加入1mol/L的鹽酸1mL，振蕩後，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
具體操作結果判別，可參考文章：綠膿菌素測定（PDP）實驗文章 點擊查看 視頻：綠膿菌素（PDP）測定實驗 點擊查看視頻
三、42℃生長試驗
舊版標準《GB 8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》中，在CN瓊脂培養基上培養出的發熒光、非藍色且非綠色的菌落，隻需進行產氨試驗確證，結果為陽性的即可判為銅綠假單胞菌；但在新版標準中，除了要做產氨試驗外，還要進行42℃生長試驗，結果也為陽性的，才能確認為銅綠假單胞菌。
這個試驗的引入，可以有效避免其它假單胞菌（如熒光假單胞菌）對檢驗結果的幹擾。熒光假單胞菌也能產生熒光，但其生長的溫度範圍為4℃-37℃，在42℃條件下培養，完全不能生長（如圖2）。通過這個試驗，可以有效減少銅綠假單胞菌的假陽性結果，更加客觀地反應出樣品的真實情況。
圖2 42℃條件下培養，銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌的生長狀態
綜合比較，新版本標準對於CN瓊脂上培養出的藍色或綠色菌落及發熒光、非藍色且非綠色的菌落，需要分別增加綠膿菌素試驗和42℃生長試驗進一步確證；而對於不發熒光的紅褐色或其它顏色的菌落，則保持舊版標準的判定方法（如表1）。
表1 銅綠假單胞菌的確證試驗
四、計數方法
（1）由於上述確認方法的引入，舊版標準中的菌數計算方法明顯存在不足（如圖3）；
圖3 舊版標準中銅綠假單胞菌菌數的計算方法
從而在新版標準中，也一並做了相應的修改（如圖4）
圖4 新版標準中銅綠假單胞菌菌數的計算方法
五、討論
除了上述確證方法有所改變之外，對於可疑菌落數的挑選和陰性對照菌等方麵，都有調整，相關檢測人員在實際工作中，要加以區分，盡量按照新標準的要求進行相關檢驗操作。
相關標準：
GB 8538-2022 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法 -點擊標準下載
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