耐熱大腸菌群檢驗方法-化妝品安全技術規範(2022年版)

1.範圍

  本規範規定了化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗方法。

  本規範適用於化妝品中耐熱大腸菌群的檢驗。

2.定義

  2.1 耐熱大腸菌群 Thermotolerant coliform bacteria

  係一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌，在44.5℃培養24h～48h能發酵乳糖產酸並產氣。

  該菌主要來自人和溫血動物糞便，可作為糞便汙染指標來評價化妝品的衛生質量，推斷化妝品中有否汙染腸道致病菌的可能。

3.儀器

  3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱:44.5℃±0.5℃。

  3.2 溫度計。

  3.3 顯微鏡。

  3.4 載玻片。

  3.5 接種環。

  3.6 電磁爐。

  3.7 三角瓶:250mL。

  3.8 試管: 18 mm×150mm。

  3.9 小倒管。

  3.10 pH計或pH試紙。

  3.11 高壓滅菌器。

  3.12 滅菌刻度吸管:10mL、1mL。

  3.13 滅菌平皿:直徑90mm。

4.培養基和試劑

  4.1 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養基

成分:	蛋白腖	40g
	豬膽鹽	10g
	乳糖	10g
	0.4%溴甲酚紫水溶液	5mL
	卵磷脂	2g
	吐溫80	14g
	蒸餾水	1000mL

  製法:將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白腖、膽鹽及乳糖溶解到其餘的蒸餾水中，加到一起混勻，調pH為7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管，每管10mL(每支試管中加一個小倒管）。115℃高壓滅菌20min。

  4.2 伊紅美藍（EMB）瓊脂

成分:	蛋白腖	10g
	乳糖	10g
	磷酸氫二鉀	2g
	瓊脂	20g
	2%伊紅水溶液	20mL
	0.5%美藍水溶液	13mL
	蒸餾水	1000mL

  製法:先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然後加入磷酸氫二鉀和蛋白腖，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。調pH值為7.2～7.4，分裝於三角瓶內，121℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化，於每100mL瓊脂中無菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL 0.5%美藍水溶液，搖勻，冷至45℃～50℃，傾注平皿備用。

  4.3 蛋白腖水（靛基質試驗用)

成分:	蛋白腖（或胰蛋白腖)	20g
	氯化鈉	5g
	蒸餾水	1000mL

  製法:將上述成分加熱融化,調pH值為7.0～7.2,分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。

  4.4 靛基質試劑

  柯凡克試劑:將5g對二甲氨基苯甲醛溶解於75mL戊醇中,然後緩慢加入濃鹽酸25mL。

  試驗方法:接種細菌於蛋白腖水中，於44.5℃土0.5℃培養24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL～0.5mL，輕搖試管。陽性者於試劑層顯深玫瑰紅色。

  注:蛋白腖應含有豐富的色氨酸,每批蛋白腖買來後,應先用已知菌種鑒定後方可使用。

  4.5 革蘭氏染色液:

  4.5.1 染液製備

  4.5.1.1 結晶紫染色液:

成分:	結晶紫	1g
	95%乙醇	20mL
	1%草酸銨水溶液	80mL

  將結晶紫溶於乙醇中，然後與草酸銨溶液混合。

  4.5.1.2 革蘭氏碘液:

成分:	碘	1g
	碘化鉀	2g
	蒸餾水加至	300mL

  將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300mL。

  4.5.1.3 脫色液:95%乙醇。

  4.5.1.4 複染液:

  (1)沙黃複染液:

成分:	沙黃	0.25g
	95%乙醇	10mL
	蒸餾水	90mL

  將沙黃溶解於乙醇中，然後用蒸餾水稀釋。

  (2)稀石碳酸複紅液:稱取堿性複紅10g，研細，加95%乙醇100mL，放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸複紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸複紅液。

  4.5.2 染色法

  4.5.2.1 將塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗。

  4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。

  4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色，約30s，或將乙醇滴滿整個塗片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個塗片，脫色10s，水洗。

  4.5.2.4 滴加複染液，複染1min，水洗，待幹，鏡檢。

  4.5.3 染色結果

  革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

  注:如用1:10稀釋石碳酸複紅染色液作複染，複染時間僅需10s。

5.操作步驟

  5.1 取10mL 1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑)培養基中，置44.5℃±0.5℃培養箱中培養24h±2h，如既不產酸也不產氣，繼續培養至48h±2h，如仍既不產酸也不產氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。

  5.2 如產酸產氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h～24h。同時取該培養液1～2滴接種到蛋白腖水中，置44.5℃±0.5℃培養24h±2h。

經培養後，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表麵光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤;或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應注意挑選。

  5.3 挑取上述可疑菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢。

  5.4 在蛋白腖水培養液中，加入靛基質試劑約0.5mL，觀察靛基質反應。陽性反應液麵呈玫瑰紅色;陰性反應液麵呈試劑本色。

6.檢驗結果報告

  經上述檢驗步驟，若發酵乳糖產酸產氣，平板上有典型菌落，並經證實為革蘭氏陰性無芽胞短杆菌，靛基質試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。

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