一、洋蔥伯克霍爾德菌簡介
洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）（1950年Burkholder首次自洋蔥根部分離）因引起洋蔥腐爛而得名，原歸類假單胞菌屬，定名為洋蔥假單胞菌。1992年，Yabuuchi等正式將該菌與類鼻疽伯克霍爾德菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌、皮氏伯克霍爾德菌和鼻疽伯克霍爾德菌等歸為一個新屬，即伯克霍爾德菌屬。該菌在醫院環境中廣泛存在，尤其在囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）和慢性肉芽腫病（chronic granulomatous disease，CGD）患者痰液中易分離到。目前國內外研究資料提示該菌臨床分離率不斷增加，且對現有的抗菌藥物具有較高的耐藥性。
洋蔥伯克霍爾德菌是一種帶尾絲革蘭陰性杆菌，在血平板上菌落呈淡黃色，濕潤、凸起、渾濁，不溶血；麥康凱平板上為乳糖不發酵菌落，細小而清晰，延長培養48h後中心呈粉紅色。
二、參考標準
《SN/T 4684-2016 進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法》
三、檢驗程序
洋蔥伯克霍爾德菌檢驗程序見圖1。
圖1 洋蔥伯克霍爾德菌檢驗程序
四、操作步驟和結果判斷
4.1 增菌培養
按照GB 7918.1方法製備1:10化妝品稀釋液，取稀釋液10mL加到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，於36℃±1℃培養24h，移取1mL，轉種於10mL含慶大黴素的BCSA增菌液內，於36℃±1℃培養18 h~24 h。
含多粘菌素B的SCDLP增菌液原理：酪蛋白腖和大豆蛋白腖提供微生物生長所需的氮源、維生素和生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；磷酸氫二鉀為培養基pH的緩衝劑；葡萄糖為可發酵的糖類；卵磷脂和吐溫80能中和防腐劑，並能起到在乳濁液中分散物質的功能，卵磷脂能中和季銨鹽，吐溫80可中和酚、六氯酚、福爾馬林，兩者結合可中和乙醇；多粘菌素B可抑製銅綠假單胞菌和其他伯克霍爾德菌生長。
用法：稱取本品31.0g，另取吐溫80 7.0g加熱溶解於1000mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌20分鍾，冷卻，使用前，按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 25000U，混勻，備用。
洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中生長良好，結果如圖2所示：
圖2 在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中的生長情況
含慶大黴素的BCSA增菌液原理：酪蛋白腖、酵母提取物提供細菌生長的基本營養；氯化鈉維持滲透壓；慶大黴素為廣譜抗生素，對多數假單胞菌屬、變形杆菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢杆菌屬等多種革蘭氏陰陽性菌有較強的抗菌活性，結晶紫主要抑製革蘭氏陽性菌和念珠菌的生長；乳糖和蔗糖為可發酵碳源；酚紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發酵蔗糖產少量酸，不發酵乳糖，生長時培養基微變黃色。
用法：稱取本品36.58g，加熱煮沸，完全溶解於1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，115℃高壓滅菌15分鍾，使用前，按每100mL培養基中加入過濾除菌的慶大黴素1mg，混勻，備用。
洋蔥伯克霍爾德菌在含慶大黴素的BCSA增菌液中生長良好，結果如圖3所示：
圖3 在含慶大黴素的BCSA增菌液中的生長情況
4.2 分離培養
分別用接種環取BCSA增菌液一環，劃線接種於BCSA瓊脂（含多粘菌素B、慶大黴素）平板和麥康凱瓊脂（含多粘菌素B、慶大黴素）平板，於32℃±1℃培養48 h，觀察各個平板上生長的菌落。
含多粘菌素B、慶大黴素的BCSA瓊脂原理：酪蛋白腖、酵母提取物提供細菌生長的基本營養；氯化鈉維持滲透壓；慶大黴素為廣譜抗生素，對多數假單胞菌屬、變形杆菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢杆菌屬等多種革蘭氏陰陽性菌有較強的抗菌活性；結晶紫主要抑製革蘭氏陽性菌和念珠菌的生長；乳糖和蔗糖為可發酵碳源；酚紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發酵蔗糖產少量酸，不發酵乳糖，生長時培養基微變黃色。
USP42標準中洋蔥伯克霍爾德氏菌特征為生長帶有黃色光環的綠棕色菌落，或被粉紅色區域包圍的白色菌落。
用法：稱取本品50.58g，加熱煮沸，完全溶解於1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15分鍾，冷卻至50℃左右時，按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 60000U和慶大黴素1mg，混勻，傾入無菌平皿，備用。
洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大黴素的BCSA瓊脂平板上的菌落為菌落呈淡黃色至淡紅色，表麵光滑，周圍培養基變紅，結果如圖4所示：
洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416
圖4 BCSA瓊脂（含多粘菌素B、慶大黴素）平板上的菌落特征
含多粘菌素B、慶大黴素的麥康凱瓊脂原理：蛋白腖提供細菌生長的基本營養；氯化鈉維持滲透壓；多粘菌素B主要抑製多數革蘭氏陰性細菌的生長，慶大黴素為廣譜抗生素，對多種革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑製作用；牛膽鹽主要可抑製革蘭氏陽性菌的生長；乳糖為可發酵碳源；中性紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌不發酵乳糖，菌落通常呈黃褐色或微紅色，周圍培養基通常不變色或因產堿變為橙黃色，而發酵乳糖的雜菌在培養基上則呈現桃紅色，菌落周圍可有沉澱環，與洋蔥伯克霍爾德氏菌區分開來。
用法：稱取本品54.03g，加熱煮沸，完全溶解於1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，115℃高壓滅菌20分鍾，冷卻至50℃左右時，按每100mL培養基中加入過濾除菌的多粘菌素B 25000U和慶大黴素1mg，混勻，傾入無菌平皿，備用。
洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大黴素的麥康凱瓊脂平板上的典型菌落為淺黃褐色圓形菌落，表麵光滑，周圍培養基通常不變色或因產堿變為橙黃色，結果如圖5所示：
洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416
圖5 麥康凱瓊脂（含多粘菌素B、慶大黴素）平板上的菌落特征
4.3 鑒定
4.3.1 初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落，同一菌株接種於2支葡萄糖氧化/發酵管，其中一支加滅菌液體石蠟封口，另一支不封口，於36℃±1℃培養24h，二者均變黃為葡萄糖發酵型，未加石蠟管變黃而加石蠟管不變色為葡萄糖氧化型。同時在營養瓊脂平板上劃線純化，於36℃±1℃培養24 h，選擇葡萄糖氧化型（加石蠟管不變黃，不加石蠟管變黃）的純培養物繼續進行鑒定；洋蔥伯克霍爾德菌的葡萄糖生化管結果如圖6所示。
圖6 葡萄糖氧化/發酵管試驗結果
4.3.2 革蘭氏染色
挑取可疑菌落塗片，進行革蘭氏染色。顯微鏡下觀察，洋蔥伯克霍爾德菌為革蘭氏陰性杆菌，如圖7所示。
圖7 革蘭氏染色鏡檢結果
4.3.3 氧化酶試驗
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落，塗布在氧化酶試劑濕潤的濾紙平板上。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩型氧化酶陽性（紫紅色、紫色或深藍色），反應時間約為2min~10min，如圖8所示。
注：實驗中切勿使用鎳/鉻材料。
圖8 氧化酶試驗結果
4.3.4 過氧化氫酶試驗
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個特征性菌落，置於潔淨載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液，觀察氣泡產生情況。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩產氣，1s後緩慢出現氣泡，如圖9所示。
圖9 過氧化氫酶試驗結果
4.3.5 蔗糖氧化
挑取可疑菌落接種於蔗糖氧化培養基，36℃±1℃培養24h，培養基變黃色為陽性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應，如圖10所示。
圖10 蔗糖氧化試驗結果
4.3.6 枸櫞酸鹽利用
挑取可疑菌落接種於西蒙氏枸櫞酸鹽培養基，36℃±1℃培養24h，培養基變藍色為陽性，綠色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應，如圖11所示。
圖11 西蒙氏枸櫞酸鹽利用結果
4.3.7 七葉苷利用
挑取可疑菌落接種於七葉苷培養基，30℃±1℃培養24h，培養基變黑色為陽性，不變色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽性反應，如圖12所示。
圖12 七葉苷利用結果
4.3.8 替代試驗
可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定係統，根據4.3.1的初步判斷結果，對可疑菌落進行鑒定。
4.4 結果報告
綜合以上試驗結果，報告10g（mL）樣品中檢出或未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。
五、附錄：
《GB/T 7918.1-1987 化妝品微生物標準檢驗方法 總則》樣品處理方法
相關標準：
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