空腸彎曲菌檢驗方法及結果判斷

一、空腸彎曲菌簡介

  空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是彎曲菌屬中的一個亞種，是引起急性腹瀉的重要病原菌，許多國家報道，本菌從腹瀉病例的分離率為5%～14%，從無症狀人群的糞便標本中分離率小於1%，目前已證明為人畜共患病菌。

  本菌為革蘭氏陰性菌，多形態，螺旋性，彎曲杆狀，有一個以上的螺旋並可長達8μm，也可出現S形或似飛翔的海鷗形；菌體一端或兩端有單根鞭毛，長度約為菌體的2～3倍，有活潑的動力或不產生動力；超過48h的培養物以衰老的球菌狀居多。

  本菌屬於微需氧菌，初次分離時需在含5%氧、85%氮和10%二氧化碳環境中，傳代後能在10%二氧化碳環境中生長，在多氧和絕對無氧的環境中均不生長。培養適宜溫度為25℃～43℃，培養最適溫度為42℃，最適pH值7.2。對糖類既不發酵也不氧化，呼吸代謝無酸性或中性產物，生長不需血清，從氨基酸或三酸循環獲得能量。

在布氏肉湯中生長呈均勻渾濁。在血瓊脂上，初次分離出現兩種菌落特征：第一型菌落不溶血、灰色、扁平、濕潤、有光澤，看上去像水滴，邊緣不規則，常沿劃線蔓延生長；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的單個菌落（直徑1nm～2nm）邊緣整齊、半透明、有光澤、中心稍渾，呈單個菌落生長。

  在國內外標準（包括美國FDA、ISO、GB等標準）中，食品中空腸彎曲菌的檢驗通常是用Bolton肉湯進行選擇性增菌培養，然後利用改良CCD瓊脂和Skirrow血瓊脂進行選擇性分離，最後進行生化鑒定。

二、參考標準

  《GB 4789.9-2014食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》點擊下載

三、檢驗程序

  空腸彎曲菌檢驗程序見圖1。

圖1 空腸彎曲菌檢驗程序

四、檢驗方法及結果判斷

  4.1 樣品處理

  4.1.1 一般樣品

  取25g（mL）樣品（水果、蔬菜、水產品為50g）加入盛有225mL的Bolton肉湯的有濾網的均質袋中（若為無濾網均質袋可使用無菌紗布過濾），用拍擊式均質器均質1min～2min，經濾網或無菌紗布過濾，將濾過液進行培養。

  4.1.2 整禽等樣品

  用200mL的0.1%的蛋白腖水中充分衝洗樣品的內外部，並振蕩2min～3min，經無菌紗布過濾至250mL離心管中，16000g離心15min後棄去上清，用10mL的0.1%蛋白腖水懸浮沉澱，吸取3mL於100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.1.3 貝類

  取至少12個帶殼樣品，除去外殼後將所有內容物放到均質袋中，用拍擊式均質器均質1min～2min，取25g樣品至225mL的Bolton肉湯中（1:10稀釋），充分震蕩後再轉移25mL於225mL的Bolton肉湯中（1:100稀釋），將1:10和1:100稀釋的Bolton肉湯同時進行培養。

  4.1.4 蛋黃液或蛋漿

  取25g（mL）樣品於125mL的Bolton肉湯中並混勻（1:6稀釋），再轉移25mL於100mL的Bolton肉湯中並混勻（1:30稀釋），同時將1:6和1:30稀釋的Bolton肉湯進行培養。

  4.1.5 鮮乳、冰淇淋、奶酪等

  若為液體乳製品取50g；若為固體乳製品取50g加入盛有50mL的0.1%蛋白腖水的有濾網均質袋中，用拍擊式均質器均質15s～30s，保留過濾液。必要時調整pH值至7.5±0.2，將液體乳製品或濾過液以20000g離心30min後棄去上清，用10mL的Bolton肉湯懸浮沉澱（盡量避免帶入油層），再轉移至90mL的Bolton肉湯進行培養。

  4.1.6 需表麵塗拭檢測的樣品

  無菌棉簽擦拭檢測樣品的表麵（麵積至少100cm²以上），將棉簽頭剪落到100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.1.7 水樣

  將4L的水（對於氯處理的水，在過濾前每升水中加入5mL 1mol/L硫代硫酸鈉溶液）經0.45μm濾膜過濾，把濾膜浸沒在100mL的Bolton肉湯中進行培養。

  4.2 預增菌與增菌

  在微需氧條件下，36℃±1℃培養4h，如條件允許配以100r/min的速度進行振蕩。必要時測定增菌液的pH值並調整至7.4±0.2，42℃±1℃繼續培養24h～48h。培養結果如圖2所示。

  Bolton肉湯原理：乳白蛋白水解物、動物組織酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各種維生素；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉和偏亞硫酸氫鈉能中和培養基的有毒物質，也能增強培養基的空氣耐受力；α-酮戊二酸提供生長因子，促進空腸彎曲菌的生長；碳酸鈉提供空腸彎曲菌最有利的酸堿環境；頭孢呱酮和多粘菌素B抑製革蘭氏陰性菌的生長；萬古黴素和三甲氧苄嘧啶抑製革蘭氏陽性菌的生長；兩性黴素B抑製酵母和真菌的生長。

  Bolton肉湯用法：稱取基礎培養基27.6g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min。待Bolton肉湯基礎冷卻至45℃左右，在無菌條件下，每100mL基礎培養基加入5mL無菌裂解脫纖維羊或馬血和1支Bolton肉湯添加劑，混勻，備用。

  注：培養基高壓滅菌後有一些小黑色顆粒。

圖2 Bolton肉湯增菌培養結果

  4.3 分離

  將24h增菌液、48h增菌液及對應的1:50稀釋液分別劃線接種於Skirrow血瓊脂與mCCDA平板上，微需氧條件下42℃±1℃培養24h～48h。培養結果分別如圖4、圖3所示。另外可選擇使用空腸彎曲菌顯色平板作為補充。

  觀察24h培養與48h培養的瓊脂平板上的菌落形態，mCCDA平板上的可疑菌落通常為淡灰色，有金屬光澤、潮濕、扁平，呈擴散生長的傾向。Skirrow血瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤，呈沿接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個菌落，邊緣整齊、發亮。

  空腸彎曲菌顯色培養基上的可疑菌落按照說明進行判定。

  mCCDA原理：肉浸液、動物組織酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源，維生素，生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改變表麵張力的作用；去氧膽酸鈉為選擇性抑菌劑；頭孢呱酮可抑製普通腸道菌生長，兩性黴素B抑製酵母和真菌生長，利福平可抑製非彎曲菌其他厭氧菌的生長。硫酸亞鐵和丙酮酸鈉有利於空腸彎曲菌的生長；瓊脂是培養基的凝固劑。

  mCCDA用法：稱取本品51.5g，加入1L蒸餾水或去離子水中，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶200mL，121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時，加入1支改良CCD瓊脂添加劑（含頭孢呱酮6.4mg、兩性黴素B2mg和利福平2mg），混勻，傾入無菌平皿，備用。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

  Skirrow瓊脂原理：蛋白陳、胰蛋白陳、酵母浸膏提供碳、氮源，維生素，生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸亞鐵有利於彎曲菌的生長。頭孢呱酮可抑製革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽性菌的生長；兩性黴素B抑製真菌生長；利福平可抑製非彎曲菌其他厭氧菌；瓊脂是培養基的凝固劑。

  Skirrow用法：稱取基礎培養基42.5g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min。待基礎培養基的冷卻至45℃左右時，加入1mL過濾除菌的FBP溶液、1支改良Skirrow氏瓊脂基礎添加劑和無菌凍溶脫纖維羊血5mL，混勻，傾入無菌平皿。預先製備的平板未幹燥時在室溫放置不得超過4天或在4℃左右冷藏不得超過7天。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖4 Skirrow瓊脂培養結果

  4.4 鑒定

  4.4.1 彎曲菌屬的鑒定

  4.4.1.1 概述

  挑取5個（如少於5個則全部挑取）或更多的可疑菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下42℃±1℃培養24h～48h，生長情況如圖5所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖5 哥倫比亞血瓊脂平板微需氧條件下42℃±1℃培養結果

  按照4.4.1.1～4.4.1.5進行鑒定，結果符合表1的可疑菌落確定為彎曲菌屬。

表1 彎曲菌屬的鑒定

  4.4.1.2 形態觀察

  挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。結果如圖6所示。

圖6 革蘭氏染色鏡檢結果

  4.4.1.3 動力觀察

  挑取可疑菌落用1mL布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀察運動狀態。

  4.4.1.4 氧化酶試驗

  用鉑/銥接種環或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在10s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽性。結果如圖7所示。

圖7 氧化酶試驗結果

  4.4.1.5 微需氧條件下25℃±1℃生長試驗

  挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下25℃±1℃培養44h±4h，觀察細菌生長情況。空腸彎曲菌在該培養條件下不生長，培養結果如圖8所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

  4.4.1.6 有氧條件下42℃±1℃生長試驗

  挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下42℃±1℃培養44h±4h，觀察細菌生長情況。空腸彎曲菌在該培養條件下不生長，培養結果如圖9所示。

空腸彎曲菌 CICC 22936	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖9 哥倫比亞血瓊脂平板有氧條件下42℃±1℃培養結果

  4.4.2 空腸彎曲菌的鑒定

  4.4.2.1 過氧化氫酶試驗

  挑取菌落，加到幹淨玻片上的3%過氧化氫溶液中，如果在30s內出現氣泡則判定結果為陽性。結果如圖10所示。

大腸埃希氏菌 ATCC 25922	空腸彎曲菌 ATCC 33291

圖10 過氧化氫酶試驗結果

  4.4.2.2 馬尿酸鈉水解試驗

  挑取菌落，加到盛有0.4mL的1%馬尿酸鈉的試管中製成菌懸液。混合均勻後在36℃±1℃水浴中溫育2h或36℃±1℃培養箱中溫育4h。沿著試管壁緩緩加入0.2mL的茚三酮溶液，不要振蕩，在36℃±1℃的水浴或培養箱中再溫育10min後判讀結果。若出現深紫色則為陽性；若出現淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。結果如圖11所示。

圖11 馬尿酸鈉水解試驗結果

  4.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗

  挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上，再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解，則在5min～10min內出現深藍色；若無顏色變化則表示沒有發生水解。不同細菌在吲哚醋酸酯紙片上的生化反應現象如圖12所示。

圖12 吲哚乙酸酯水解試驗結果

  空腸彎曲菌的鑒定結果見表2。

表2 空腸彎曲菌的鑒定特征

	空腸彎曲菌 （C. jejuni）	結腸彎曲菌 （C. coli）	海鷗彎曲菌 （C. lari）	烏普薩拉彎曲菌 (C. upsaliensis)
過氧化氫酶試驗	+	+	+	－或微弱
馬尿酸鹽水解試驗	+	-	-	-
吲哚乙酸酯水解試驗	+	+	-	+
注：＋表示陽性；－表示陰性。

  4.4.2.4 替代試驗

  對於確定為彎曲菌屬的菌落，可使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡代替4.4.2.1~4.4.2.3進行鑒定。

  4.5 結果報告

  綜合以上試驗結果，報告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。

相關標準：

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注:本文屬betway必威西汉姆联生物原創,未經允許不得轉載。

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