一、簡介：
在進行微生物試驗時，菌種的挑選特別重要。除了要選對菌種外，還要注意對菌體生長狀態的把握。
通常來說很多標準中都對試驗用菌有要求，有的會明確要求用培養多長時間的菌進行後續試驗，食品檢驗標準中經常可以看到這類描述，如“挑取單個典型黑色菌落接種到FTG培養基，36℃±1℃培養18h～24h，用於後續的確證試驗。”“取生長旺盛的FTG培養液1 mL接種於含鐵牛乳培養基……”（參考GB4789.13 食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗），而有些標準則不厭其煩地強調“新鮮培養物”，如《中國藥典》中，在培養基靈敏度檢查部分，就再三強調這一點，“菌液製備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養物至胰酪大豆腖液體培養基中或胰酪大豆腖瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30°C～35°C培養18h～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上”（參考《中國藥典》 2020版 第157頁）……
二、試驗說明
標準中之所以這麽要求，是希望能用最優狀態的菌種，做出最明顯的效果，保證試驗結果的可靠性。本文以平板上不同區域菌體的形態差別對此問題進行說明：分別將大腸埃希氏菌（典型的革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（典型的革蘭氏陽性菌），在TSA平板上三區劃線、培養，然後將每種菌分別從同一平板上的三個區域挑菌、塗片、鏡檢，觀察它們的菌體形態，為了方便觀察，塗片後先用結晶紫進行染色，再進行鏡檢觀察。結果如下（圖1、圖3）：
圖1 大腸埃希氏菌在平板上三區劃線培養後的菌落及菌體狀態
大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，革蘭氏陰性短杆菌，大小0.5微米~0.5×3微米。從鏡檢結果不難發現，同一平板上不同區域長出的菌體，形態差別非常明顯：一區的菌體為短杆狀甚至點狀，有些菌體已經明顯衰亡；二區杆狀形態的菌體明顯增多，且比一區的杆狀菌體較長、較粗；三區菌體全部為較長的杆狀且非常粗壯，與對數生長期菌體在掃描電鏡下的狀態基本一致（如圖2）。
圖2 掃描電鏡下對數生長期的大腸埃希氏菌形態
金黃色葡萄球菌，作為一種典型的革蘭氏陽性菌，三個區域內菌體差異雖然沒有那麽顯著，但也呈現出同樣的規律（如圖3）。
圖3 金黃色葡萄球菌在平板上三區劃線培養後的菌落及菌體狀態
三、討論：
同一平板的不同區域的同一種菌呈現不同的形態，可以直觀解釋為一區菌體密度太大，二區次之，三區菌體密度較小所致。其根本原因在於，同等麵積的區域上菌體密度過大，會造成菌體間營養競爭，有些菌體因為營養不良生長較差或長不出來，同時區域內的優勢菌株還可能產生一些細胞毒素等，遏製其它菌體的生長。而三區內的菌營養比較充足，生長幾乎不受影響，所以菌體狀態最好。
我們做實驗時，通常都會要求用生長狀態最好的菌，有時候用新鮮菌體能做出很明顯的陽性結果，但如果菌體不新鮮，就會形成假陰性結果（參考氧化酶試驗的操作方法及注意要點）。
綜上所述，在微生物試驗過程中，無論製作菌液還是進行菌株鑒定等，一定要注意菌體的新鮮度和菌體的健壯程度，盡量選用新鮮健壯的菌體進行試驗。如果是在平板上挑菌，我們通常挑取三區生長的單菌落進行後續試驗。
相關標準：
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