培養基不能正常凝固的原因及解決辦法

  瓊脂具有特殊的溶點和凝固點，所含成分很難被微生物分解利用且不含抑製性成分，因此很適用於微生物培養基的製備，從而作為固體培養基最常用的凝固劑，到目前為止，在這方麵世界上還沒有一種能夠完全替代瓊脂的代用品。

  一些初期從事植物組織培養工作或微生物培養的人員，尤其是初學者，在配製培養基時往往會遇到培養基難以正常凝固的現象：或呈半流體、或完全呈液體狀態、同時還會現出各種顏色。本文將對瓊脂的凝固性以及影響其凝固性的關鍵因素作係統的介紹，並針對不同的操作方法進行問答式評價，以期能幫助更多的人解決實際工作中的相關問題，少走彎路。

一、有關瓊脂的知識

  瓊脂，又名瓊膠或凍粉，因最初從日本海藻中提取，故又稱“洋菜”。瓊脂成品為白色或淡黃色粉末狀或細條形，主要是由複雜的大分子多糖類物質組成。其水解物的組成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸，實際上，它是瓊脂膠和瓊脂糖兩種成分的混合物。瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯，瓊脂糖主要依靠氫鍵的引力形成網狀結構。因此，瓊脂糖凝膠的穩定性比那些以化學鍵交聯而形成網狀結構的凝固劑的穩定性要差一些。

  瓊脂溶於熱水而不溶於冷水，因此在配製培養基時需煮製瓊脂。隨著溫度的升高，瓊脂逐漸溶解，當溫度下降到40℃時則開始凝固。配製培養基時應注意，由於各地生產的瓊脂的質量不同，同樣濃度的瓊脂水溶液凝固後在硬度、透明度及色澤上會有所差異。劣質瓊脂不僅凝固性差，而且帶有很多雜質。

二、有關瓊脂凝固性的知識

  作為培養基的凝固劑，瓊脂的凝固性除與瓊脂本身的品質有關外，還會受到滅菌溫度、滅菌時間、瓊脂量和pH值的影響。

  （1）0.7%～0.8%的瓊脂水溶液在冷卻後會很好凝固，對於常用的微生物培養基，瓊脂的用量基本趨於穩定，通常條狀瓊脂的用量約為2%，粉狀瓊脂的用量為1%～1.5%。

  （2）培養基的酸堿度對瓊脂的凝固性影響很大，是瓊脂在正常濃度範圍內能否凝固的關鍵因素，當4.30

  （3）在4.30²，120℃)的影響很小，延長高溫高壓滅菌時間或反複高溫高壓處理均不會影響其凝固性。pH較高(5.0-8.0)時，瓊脂濃度是影響凝固等級的主要因素。

  （4）當配製的固體培養基pH低於3.44時，其凝固性會受到滅菌溫度、滅菌時間、瓊脂量和pH值的影響。其中滅菌溫度、滅菌時間與瓊脂凝固性呈負相關，瓊脂量、pH值與瓊脂凝固性呈正相關。但在這些因素中，瓊脂量的影響不是很大，因此在該類培養基的滅菌過程中應該重點把握好滅菌溫度、滅菌時間和pH值。使用較低的滅菌溫度，較短的滅菌時間，適當地增加培養基的pH值就可以顯著提高瓊脂的凝固性。pH較低(≤4.0)時，pH是影響凝固等級的主要因素。

三、案例分析

  基於實驗得出的理論知識，大家都比較好理解和接受，但在實際操作過程中，經常會有人碰到瓊脂不能凝固的情況（如圖1），下麵針對具體案例進行分析討論：

圖1 滅菌後的培養基出現分層現象

案例一

  問：我使用的是**生產的瓊脂，用冷水就能溶解了，高壓蒸汽滅菌後就能使用了，最近在倒平板時，發現有幾塊怎麽也不凝固，同一瓶子裏的瓊脂隻有幾塊不凝固，我專門放到第2天發現還是稀呼呼的。

  答：首先糾正一下，您說用冷水就能溶解了，這肯定不對：瓊脂溶於熱水而不溶於冷水，將瓊脂放在冷水中，充其量隻能是把瓊脂浸濕了泡軟了，根本達不到溶解的程度，也就談不上均勻地分散在培養基溶液中了。既然分散不均勻，滅菌後倒出的平板，就容易產生瓊脂含量不一的結果，表現出來的現象就是您所描述的，同一瓶子裏的瓊脂，有幾塊怎麽也不凝固，即使放到第2天或更多天，也不會凝固，因為裏麵的瓊脂含量很少啊，達不到凝固的要求，即使放再多時間結果也是一樣。

  問：必須要完全煮化嗎？

  答：瓊脂必須煮沸，常溫下是溶解不了的，隻有煮沸後再冷卻才會凝固。

  問：夏天溫度高的時候是不是就不用煮沸了？

  答：配好培養基後，一定要加熱攪拌溶解。培養基外包裝標簽上說得很清楚，要加熱煮沸至完全溶解，夏天溫度再高也不會超過50度吧？所以天氣熱了也要這麽做，使得培養基中各成分混合均勻。步驟不要省略！！！

  問：那我們以前都是同樣的操作，怎麽都好著呢？

  答：正確的培養基配製方法應該是先將含瓊脂培養基煮沸至完全溶解之後，再分裝入三角瓶中進行滅菌，並且滅菌完畢從鍋裏拿出來後，要及時搖一搖三角瓶（用力搖），使滅菌後的培養基中瓊脂能夠均勻分散在裏麵，然後再傾倒平皿。你之前沒出問題，不代表你的操作就是合乎要求的，你不按照正規的方法操作，遲早會出問題的，這不就被你碰到了嗎？

  另外，即使滅菌前沒有先煮沸再分裝滅菌，隻在滅菌完畢，開鍋後第一時間將瓶內培養基搖勻，也就不會出現你碰到的問題了。

  這裏需要注意，搖勻，一定是用力搖勻，而不是隨手輕輕一晃就行了。

  問：為何還要搖啊？你在煮沸、滅菌時，不就自然勻了嗎？

  答：滅菌時能自然勻了？這也是你自己認為的吧？當然很多人都會這麽認為。熬粥的時候滿鍋裏都沸騰，稍放置一會兒，鍋底的粥是不是要稠一些？大同小異！

  問：可是滅菌後搖晃容易產生氣泡啊？

  答：開鍋拿出來後手搖幾下就勻了，少量氣泡稍微靜置就會消掉的，或者放到水浴鍋裏恒溫到50度的時候一般就沒有氣泡了。臨倒平板前就不要搖了！那時候再搖，氣泡可能就不容易消掉了。

  問：那我怎麽搖勻？我用500mL的三角瓶配500mL培養基，根本搖不起來！

  答：問題就出來這裏，做微生物實驗，將配好的培養基分裝到適當容器中，培養基體積不應超過容器容積的2/3(可參考GB 4789.28食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求)。也就是說不要將瓶子裏裝得滿滿當當的，這樣很容易導致瓊脂沉在下麵，不容易搖勻。

  我們平時做實驗，配500mL培養基用1000mL的瓶子，配200mL培養基用500mL瓶子，500mL的瓶子裏最多裝400mL培養基的，你比較看看你的裝量。

  問：我們一直都這麽配製的，隻是最近的出了問題，同一瓶培養基，隻有幾個板這樣的。

  答：培養基的標簽上有明確的用法：稱23.5 g於1 L蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，121攝氏度滅菌15分鍾，冷卻至46攝氏度左右備用。

  對比上麵的解答，看看你們一直以來的操作有哪些問題吧，然後按照正規的操作要求再堅持一段時間，再出現同樣的問題再來找我好吧？(不搖勻的情況下，同一瓶培養基倒出的平板強度差異很大，可參考附錄表格)。

案例二

  問：配製的是營養瓊脂培養基，都是按照上麵說的配製的，滅菌後放入冰箱怎麽也不能完全凝固，在底部還有非常硬的像膠皮一樣的腖。請幫忙看看到底是怎麽回事。

  答：有沒有想過最底部的非常硬的膠皮一樣的東西是什麽？那就是相對很濃的瓊脂液冷卻形成的。如果把這一部分瓊脂趁熱搖勻，使其均勻分散在整瓶培養基裏麵呢？是不是上麵就沒那麽稀了，能凝固了，下麵也沒那麽稠了，硬度合適了。也就是說搖勻後倒平皿，整瓶培養基都能用了。

  你滅菌後沒經過搖勻，瓊脂本來就沉積在瓶底，直接放入冰箱，瓶底迅速冷卻，大量的瓊脂就先凝固了，瓶子上麵的部分含瓊脂就很少了，所以才會不凝固。不管放多久都不會改善啊！

  問：聽說瓊脂太酸也不會凝固，是不是我們使用的培養基pH不合格啊？

  答：pH合格不合格，你測一下不就知道了。在pH 5-10之間，pH對瓊脂的凝固性影響並沒有那麽大。你用的都是常規培養基，pH怎麽可能那麽低嘛。另外，如果是pH值太低的話，加熱以後瓊脂會變性，底部就不會有凝固的瓊脂硬塊了，而會成一瓶糊糊。你這顯然是瓊脂混合不均勻引起的，使用前用微波溶化，晃一晃就好了。

  問：用兩個大燒杯把融化了的培養基來回傾倒混勻，然後倒皿，效果不錯。

  答：道理是一樣的，就是為了使瓊脂混合均勻。但這種操作方法有點繁瑣，並且容易染菌，不提倡。

  問：像我這種情況，培養基還能用嗎？

  答：能用！重新水浴加熱，讓其完全溶解後，搖勻，傾倒平板即可。或者用微波加熱，要注意隨時觀察，經常拿出來搖一搖，以免培養基噴出。

  問：培養基可以多次這樣反複融化使用嗎？

  答：不建議！如果不是不得已，建議現滅現用。

案例三

  問：今天分別用了伊紅美藍瓊脂和營養瓊脂兩種培養基做斜麵，然而滅菌後做斜麵都不凝固，這是為啥？有的凝固也就是一半凝。

  我的步驟：如營養瓊脂，按配比稱3.3g加100mL水，加熱攪拌溶解，分裝到試管中後加棉花塞，包紮後於121℃滅菌鍋中滅菌20分鍾，好了之後製作斜麵，等了有半小時久，培養基都不凝固這是為何？

  答：你先要煮沸溶解培養基，攪拌均勻，稍冷後（50℃）盡快分裝，瓊脂的在水中需加熱至95℃時才開始熔化，你隻是加熱攪拌溶解，瓊脂是不是真正溶解透了有待考證。

  試管滅菌完畢，拿出來晃一晃再擺斜麵，否則容易上層稀不凝固，下層濃很容易凝固。跟三角瓶滅培養基是一樣的道理。

  問：我煮了還是沒很凝固這是為什麽？

  答：先加熱煮沸，直至白色泡沫上升，然後再分裝、高溫高壓滅菌。

  問：白色泡沫上升好危險，我試過被瓊脂沸騰連塞子噴我一臉！

  答：我們通常都是用搪瓷缸，最多裝液量1/3，煮沸三次，徹底煮透、溶透。

  問：溶解後用吸量管分裝，在吸量管中就凝固了，要怎麽分裝？量筒嗎？

  答：我們都是用10 mL或5 mL移液槍分裝的，再把分裝試管塞好滅菌。

  煮沸溶解分裝然後滅菌製斜麵成功了！再次提醒，滅菌後，溫度沒降下來前一定要搖一搖，不管瓶裝還是試管裝，都要搖勻！！

案例四

  問：瓊脂培養基製作斜麵為什麽無法完全凝固，而做培養皿時完全凝固？

  答：瓊脂混合不均勻。相比三角瓶，試管的空間更加狹小，開鍋後一定要趁熱晃一晃，使底部沉積的瓊脂完全混勻。否則就容易導致試管底部凝固，而上部不凝固或凝固不好的問題。

案例五

  問：微生物檢驗用的營養瓊脂培養基，可以第二次高壓滅菌麽?有何影響，如果加熱培養基使其溶化後，不一會兒就會凝，而如果用高壓滅菌就不會很快凝固，所以想再用高壓濕熱滅菌，加熱使其溶化，可否?

  答：二次高壓濕熱滅菌，會導致營養成分的損失。所以，最好是通過水浴加熱，溫度維持在100度，瓊脂就可完全化開，冷卻至50度左右，就可進行倒板等操作了。

  問：培養基能加熱幾次?營養瓊脂和玫瑰紅鈉配置好了以後，我是保藏在冰箱裏的，同一瓶最多能水浴幾次使用呢?

  答：在保證不染菌的情況下是可以多次使用的。瓊脂的溶解溫度是95度，若水浴的話時間來得及可以是沸水浴。若是時間緊迫可直接放在電爐上熔化，但要一直盯著，防止沸出來。如果是已經滅好菌的玻璃器皿，可以用微波爐加熱，不過要注意觀察，防止沸騰出來。一般從冰箱裏拿出來就用一次，不提倡反複融化。

  問：有人說加熱時間過長，也會導致瓊脂不凝固，是這樣嗎？

  答：是的。通常來說，滅完菌就要及時開鍋取出培養基。如果因為其他原因，耽誤了，稍有延長也不大要緊，這裏所說的加熱時間過長，是指高壓超過半小時或者滅菌後一直放在滅菌鍋內很長時間甚至過夜的情況。這些都是錯誤的操作，即使培養基能凝固，裏麵的營養成分也發生了很大的變化，對實驗結果的判斷造成很大影響。應該杜絕類似的操作。

  通過上述幾個案例的分析，我們可以總結一下。遇到固體培養基不凝固的情況，通常首先考慮一下幾點：

  （1）瓊脂少，特別是自己配製培養基時，可能根本就漏加瓊脂了；

  （2）pH值不對，實驗室用水PH過低，且配製完沒能調整pH，或者本身就是酸度很大的培養基；

  （3）反複加熱；

  （4）加熱時間過長；

  （5）滅菌前是否煮沸溶透，滅菌後是否搖勻。

  結合自己的實際操作，一項一項排除查找原因。這裏麵，最簡單也最容易被忽視的就是滅菌後搖勻的問題。

  本實驗室試驗對比發現，傾倒平皿前搖勻與不搖勻，所形成的平板強度差異很大，如果不經搖勻直接傾倒，形成的平板有約有2/3凝膠強度過低，不能滿足試驗要求，而最後倒出的幾塊平板強度會急劇升高，硬度過大，也影響使用；而搖勻後再傾注的平板，凝膠強度數值分布比較均勻，滿足試驗要求（表1，圖2）。經常聽到有人說，平常一直那麽做（不煮沸，不搖勻），都沒問題，實際上那樣倒出來的平板隻是都凝固了而已，即使能用，平板間凝膠強度的差異也是很大的。

  希望大家在實際操作中一定注意，嚴格按照說明書的要求進行操作。

附圖表：

表1 用相同方法配製的等量培養基開鍋後搖勻與不搖勻傾倒成的平板強度

圖2 傾倒平板前培養基搖勻和不搖勻所傾注的平板強度規律

相關標準：

GB 4789.28-2013 培養基和試劑的質量要求 點擊下載

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