一些細菌在生長過程中，可以產生溶血素，使紅細胞破裂溶解，在血平板上生長時，菌落周圍可觀察到透明或半透明的溶血環，許多細菌的致病性都與溶血特性相關。由於不同細菌產生的溶血素不同，溶血能力也不相同，在血平板上的溶血現象也不相同，因此，溶血試驗常用來進行細菌的鑒定。
（1）α溶血、β溶血和γ溶血
α溶血又稱草綠色溶血，在菌落周圍可觀察到1~2mm的草綠色半透明溶血環，為高鐵血紅蛋白所致，α溶血環中的紅細胞未完全溶解，是一種不完全溶血現象，常見的產生α溶血的菌株為肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌。
圖1 肺炎鏈球菌在血平板上的α溶血現象
β溶血又稱為完全溶血，在菌落周圍可觀察到2～4mm界限分明、完全透明的溶血環。β溶血環中的紅細胞完全溶解，是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致，許多致病性強的菌株都可形成β溶血，如乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等。γ溶血即不溶血，菌落周圍無溶血現象。
注：製作溶血試驗用的血平板，特別是金黃色葡萄球菌的溶血試驗，通常選用脫纖維綿羊血。這是因為綿羊紅細胞的細胞膜中的神經鞘磷脂含量較高，金黃色葡萄球菌產生的β溶血素作用於神經鞘磷脂裂解紅細胞，試驗中更易觀察到溶血現象。
圖2 金黃色葡萄球菌的β溶血和糞腸球菌的γ溶血
注：部分金黃色葡萄球菌不表現β溶血
圖3 蠟樣芽胞杆菌的β溶血
注：部分蠟樣芽胞杆菌表現為α溶血
圖4 產氣莢膜梭菌的β溶血
注：產氣莢膜梭菌有兩種溶血素，能產生雙溶血環，在β溶血環外圍可隱約看到寬度約為3-5mm的不透明微弱溶血環
（2）李斯特氏菌溶血試驗
圖5 李斯特氏菌溶血試驗
單增李斯特氏菌的溶血現象較弱，直接采用劃線接種方法時在血平板上較難觀察到溶血現象，因此在《GB4789.30-2016單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》標準中，采用穿刺接種法可以更好的觀察到李斯特氏菌的溶血現象，單增李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌可觀察到明顯的β溶血環，英諾克李斯特氏菌無溶血。
（3）協同溶血試驗（CAMP）
一些細菌能產生CAMP因子，可促進葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細胞的活性，因此在兩菌的交界處溶血力增加，出現箭頭狀或半月狀透明溶血區域。該試驗常用於B群鏈球菌的鑒定，也用於單增李斯特氏菌的鑒定。
試驗方法：挑取金黃色葡萄球菌ATCC25923在血平板上劃平行直線，再挑取待測菌株垂直劃線，距離金黃色葡萄球菌接種線約1mm但不要接觸，置於36℃培養24-48h。
注：為何使用金黃色葡萄球菌ATCC25923做協同溶血試驗，而不是任意一株金黃色葡萄球菌都能做？
金黃色葡萄球菌發生溶血主要靠四種溶血素：α、β、γ和δ。其中α、γ和δ溶血素又稱為“打孔毒素”，在細胞膜上形成孔道，小分子和離子可以自由進出細胞，導致細胞代謝發生紊亂，最終發生裂解。而β溶血素的溶血機理不同，是通過水解細胞膜的鞘磷脂裂解細胞。多數金黃色葡萄球菌都有兩種以上的溶血素基因高效表達，在血平板上可觀察到完全透明的β溶血環，少數金黃色葡萄球菌隻有β溶血素基因高效表達或無溶血素基因表達，在血平板上微弱溶血或不溶血。
金黃色葡萄球菌ATCC25923是一株表型不完全溶血的菌株，該菌主要產生β溶血素，在血平板上溶血現象非常微弱。B群鏈球菌可以產生一種CAMP蛋白（非酶蛋白），可以與β溶血素協同作用快速裂解紅細胞，產生溶血現象。因此，在靠近金黃色葡萄球菌ATCC25923的B群鏈球菌周圍可以觀察到明顯的溶血增強現象。而其他金黃色葡萄球菌若不產生β溶血素或本身產生多種溶血素形成了完全透明的β溶血，則無法發生協同溶血或無法觀察到協同溶血現象。
圖6 無乳鏈球菌（B群鏈球菌）協同溶血試驗
圖7 李斯特氏菌協同溶血試驗
（4）神奈川現象
該試驗是副溶血性弧菌特有的溶血現象，副溶血性弧菌在普通血平板上不溶血或隻呈現α溶血，但在含高鹽（7%）的人O型血或兔血以及D-甘露醇做為碳源的我妻氏瓊脂平板上可產生β溶血。副溶血性弧菌致病性越強，溶血現象越明顯。
圖8 神奈川試驗現象（左為副溶血性弧菌，右為溶藻弧菌）
（5）培養基的選擇及製備注意事項
在《GB4789.10-2016金黃色葡萄球菌檢驗》標準中，使用的是豆粉瓊脂加5%-10%的脫纖維羊血或兔血；在《GB4789.11-2014β型溶血性鏈球菌檢驗》標準中，使用的是哥倫比亞血瓊脂基礎加5%脫纖維綿羊血；在《GB4789.14-2014蠟樣芽胞杆菌檢驗》標準中，使用的是胰酪腖大豆羊血瓊脂；在《GB4789.30-2016單增李斯特氏菌檢驗》標準中，使用的是5%-8%的羊血瓊脂。其他文獻或標準中也有使用TSA或BHI補加5%-10%脫纖維羊血做成的血瓊脂。以上培養基做出來的效果基本一致，本質上都是觀察溶血效果，選擇哪種培養基並不影響結果觀察（注：神奈川試驗使用的是單獨的我妻氏培養基加入兔紅細胞製成的平板，該培養基不能用於其他溶血試驗觀察）。
注意事項：
1.血液要選用新鮮的無菌脫纖維血，製備如血液出現變色則不能使用。
2.配製培養基時，應預先將血液溫育到40-50℃左右，待培養基冷卻至50℃左右時加入血液，輕輕搖勻。若血液與培養基溫差過大，製成的平板易出現凝塊。若搖晃幅度過大，易產生大量氣泡，製成的平板不平整。
3.血液對溫度比較敏感，加入血液時培養基溫度不能過高，加入血液混勻後應立即倒平板，不能長時間保溫，否則會導致製成的平板顏色偏深。
4.製成的平板不宜過厚，15mL-20mL為宜，平板過厚不利於觀察溶血環。
5.製成的平板應在2-8℃左右低溫冷藏，不宜儲存過久，若儲存過程發現平板變黑或變透明，則不能使用。
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