一、標準
《GB4789.36-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》第一法：常規培養法
二、大腸埃希氏菌O157:H7/NM簡介
大腸埃希氏菌是動物腸道中正常菌群之一，極少數可引起人類疾病，具有致病性的大腸埃希氏菌主要由六種致瀉大腸埃希氏菌（DEC）組成：腸道致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、產腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、產誌賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）。大腸埃希氏菌O157屬於腸道出血性大腸埃希氏菌（EHEC），O157:H7為常見血清型代表菌株，O157:NM為無動力菌株。
三、檢驗流程
3.1 增菌
以無菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mL mEC+n肉湯的均質袋中,在拍擊式均質器上連續均質1 min~2 min；或放入盛有225 mL mEC+n肉湯的均質杯中,8000r/min~10000r/min均質1min~2min。 36 ℃±1℃培養18h~24h。
3.2 分離
取增菌後的mEC+n肉湯，劃線接種於CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上，36℃±1℃培養18h~24h，觀察菌落形態。
（1）改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）
大腸埃希氏菌O157通常不發酵或遲緩發酵山梨醇，而大腸埃希氏菌則可以發酵山梨醇產酸，因此常用山梨醇麥康凱瓊脂或改良山梨醇麥康凱瓊脂分離大腸埃希氏菌O157。大腸埃希氏菌O157在CT-SMAC平板上由於不能分解山梨醇產酸，通常為圓形無色菌落，中心顯灰褐色，而能發酵山梨醇產酸的大腸埃希氏菌、沙門氏菌等在CT-SMAC上菌落顯粉紅色或桃紅色，菌落周圍有時可見沉澱環。
CT-SMAC平板上的大腸埃希氏菌O157（左）和普通大腸埃希氏菌（右）
（2）O157菌顯色培養基
O157菌顯色培養基利用特異性酶底物法原理，大腸埃希氏菌O157在顯色培養基上呈亮紅色菌落，而大腸埃希氏菌、沙門氏菌、大腸菌群等在顯色培養基上呈藍色。
O157菌顯色培養基——大腸埃希氏菌O157（左）、大腸埃希氏菌（右）
3.3 初步生化試驗
在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個~10個可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種 MUG-LST 肉湯，並用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標準菌株)做陽性對照和大腸埃希氏菌O157：H7(NCTC12900或等效標準菌株)做陰性對照，於36℃±1℃培養18h~24h。必要時進行氧化酶試驗和革蘭氏染色。
注：挑取可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和LST-MUG後，可同時劃線至營養瓊脂平板，以備後續做血清學試驗和生化試驗使用。
（1）三糖鐵瓊脂（TSI）試驗
挑取可疑菌落在三糖鐵斜麵“之”字形劃線並穿刺接種後，置於36±1℃培養18-24h。大腸埃希氏菌O157與大腸埃希氏菌在三糖鐵瓊脂上反應相同，均可發酵乳糖和葡萄糖產酸產氣，不產硫化氫，現象為斜麵和底層均為黃色（A/A），底層無黑色出現（H2S陰性），瓊脂可見斷層（產氣）。若斜麵出現紅色（K/A或K/K），或底層出現黑色（H2S陽性），均可排除大腸埃希氏菌O157。
TSI試驗現象
TSI使用注意事項：（1）配製時需加熱煮沸至瓊脂完全溶解，分裝至試管。若瓊脂未完全溶解就進行分裝，易出現滅菌後培養基不凝固問題；（2）培養過程中斜麵需要與空氣中的氧氣發生反應，因此必須使用透氣性良好的試管塞或半開蓋培養，不可密閉培養。
（2）LST-MUG熒光試驗
挑取可疑菌落接種至LST-MUG培養基中（需同時接種MUG陽性的大腸埃希氏菌和MUG陰性的大腸埃希氏菌O157做對照），置於36±1℃培養18-24h。培養結束後，在黑暗中使用365nm波長紫外燈照射，觀察有無熒光。大腸埃希氏菌O157不能分解MUG產熒光，而大腸埃希氏菌可分解MUG產熒光。
MUG試驗（左為大腸埃希氏菌有熒光，右為大腸埃希氏菌O157無熒光）
注：在標準附錄A培養基的配製方法中，要求配製LST-MUG需使用帶小倒管的試管，但在檢驗過程中卻並未要求觀察是否產氣。大腸埃希氏菌O157和大腸埃希氏菌都是可以發酵乳糖產氣的，因此在試驗中還可以看到小倒管中有氣體產生（標準未提及）。
（3）革蘭氏染色
大腸埃希氏菌O157為革蘭氏陰性杆菌（紅色杆菌）。
（4）氧化酶試驗
紙片法：使用少量無菌生理鹽水潤濕氧化酶試紙，用塑料接種環挑取可疑菌落塗抹至氧化酶試紙，陽性結果通常在30秒內出現深藍色（若使用的氧化酶試劑為N,N'-二甲基對苯二胺鹽酸鹽，陽性結果為紫紅色），2分鍾內不變色即為氧化酶陰性。大腸埃希氏菌O157氧化酶試驗為陰性，不出現深藍色。
氧化酶試驗（左為大腸埃希氏菌O157陰性，右為銅綠假單胞菌陽性）
注意事項：挑取菌落時應使用塑料接種環，玻璃棒或鉑金接種環，不可使用鐵製品，否則可能出現假陽性反應。
3.4 鑒定
（1）血清學試驗
在營養瓊脂平板上挑取分離純化的菌落，用O157和H7診斷血清或 O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗。對於H7因子血清不凝集者，應穿刺接種半固體瓊脂，檢查動力，經連續傳代3次，動力試驗均陰性，確定為無動力株。
注：需同時使用O157血清和H7血清做凝集試驗，若均凝集，則為大腸埃希氏菌O157:H7菌株；若O157血清凝集而H7血清不凝集，需穿刺接種半固體瓊脂檢查動力，若連續傳代3次動力試驗均為陰性，則為大腸埃希氏菌O157:NM菌株；若傳代過程出現動力陽性，可再次使用H7血清做凝集試驗，檢查是否為O157:H7菌株。
（2）生化試驗
大腸埃希氏菌O157生化反應結果：靛基質陽性，山梨醇發酵為陰性或遲緩陽性，甲基紅（MR）陽性，V-P陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，鳥氨酸脫羧酶陽性，西蒙氏檸檬酸鹽陰性，纖維二糖陰性，棉子糖陽性，O157:H7菌株動力陽性，O157:NM菌株動力陰性。
注：1.靛基質、甲基紅、VP試驗均需培養結束後滴加相應試劑觀察結果，靛基質和甲基紅試驗滴加試劑後應立即觀察結果，VP試驗滴加試劑後應繼續培養0.5-4h觀察結果；2.賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶試驗需同時做氨基酸脫羧酶對照管，接種後並覆蓋無菌液體石蠟，當對照管變黃，試驗管變紫時為氨基酸脫羧酶陽性反應，若對照管與試驗管均為黃色，則為氨基酸脫羧酶陰性反應，若對照管未變黃色，可能試驗菌為非發酵型細菌，不能直接判斷氨基酸脫羧酶反應的陰陽性（O157菌為發酵菌，對照管必變黃）；3.山梨醇遲緩發酵型細菌，培養24h內通常觀察不到陽性結果，需延長培養2-7天後可見陽性結果。
大腸埃希氏菌O157:H7生化鑒定結果
3.5 毒力基因測定（選做）
樣品中檢出大腸埃希氏菌 O157:H7或 O157:NM 時，如需要進一步檢測 Vero細胞毒素基因的存在，可通過接種 Vero細胞或 HeLa細胞，觀察細胞病變進行判定；也可使用基因探針檢測或聚合酶鏈反應(PCR)方法進行誌賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly 等基因的檢測。
3.6 結果報告
綜合生化和血清學試驗結果，報告25g(或25mL)樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌 O157:H7或大腸埃希氏菌 O157:NM。
注：出具結果報告時，要寫明檢出的O157菌的具體血清型是H7或NM。
注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。
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