糞腸球菌檢驗標準操作程序

標準依據：《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》

1 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。

1.1 恒溫培養箱和恒溫厭氧培養箱:37℃士1℃。

1.2 冰箱:2℃～5℃。

1.3 天平:感量為0.1g。

1.4 均質器及無菌均質袋,均質杯。

1.5 振蕩器。

1.6 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

1.7 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL。

1.8 無菌培養皿:直徑90mm。

1.9 顯微鏡:10倍一100倍。

1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

2 培養基和試劑

2.1 KF鏈球菌瓊脂培養基。

2.2 腸球菌肉湯。

2.3 無菌生理鹽水。

2.4 革蘭氏染色液。

2.5 細菌生化鑒定試劑盒。

3 檢驗程序

糞腸球菌的檢驗程序見下圖。

4 操作步驟

4.1 樣品製備

4.1.1 固體和半固體樣品

稱取25g樣品，置於225 mL生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打lmin～2min製成1:10的樣品勻液；或置於盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中,8000r/min～10000r/min均質lmin～2min製成1:10的樣品勻液。

4.1.2 液體樣品

應先將其充分搖勻後,以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分振搖﹐製成1:10的樣品勻液。

4.2 樣品稀釋

4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取l:10樣品勻液lmL,沿管壁緩慢注於裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻,製成l:100的樣品勻液。

4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次lml滅菌吸管或吸頭。

4.3 培養

根據對待檢樣品菌含量的估計,選擇2個～3個連續的適宜稀釋度﹐每個稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種於KF鏈球菌瓊脂平板內,使用塗布棒盡可能小心快速地塗布接種液於瓊脂表麵,塗布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。塗布後,將平板靜置10 min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置於37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。

4.4 菌落計數

4.4.1 選取特征菌落數在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30 CFU的平板記錄具體菌落數,大於300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半,而其餘一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板後乘以2,代表一個平板菌落數。

4.4.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。

4.5 鑒定

4.5.1 菌落挑選和純培養

挑選平板上5個暗紅色至粉紅色,表麵光滑,周邊整齊的菌落分別轉入腸球菌肉湯培養基37℃±1℃恒溫培養箱中培養24h±2h後進行形態學、生化鑒定。

4.5.2 形態學鑒定

革蘭氏染色,鏡檢。糞腸球菌為革蘭氏陽性球菌,呈球形或橢圓形,直徑0.5u.m～1.0um,成對或短鏈狀排列,無芽孢。

4.5.3 生化鑒定

使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。鑒別特征參見表B.5。腸球菌屬常見菌種主要鑒定特征見表C.2。

5 結果計算

5.1每個平板中糞腸球菌的數量

每個平板中糞腸球菌菌落數的計算見式(1):

  a=b/A×C                ...............（1）

  式中

  a-每塊平板上的糞腸球菌菌落數；

  b-挑取後經證實為糞腸球菌的菌落數；

  A-挑取平板上用於驗證的菌落數；

  C-平板上的所有特征菌落數。

5.2 菌落總數的計算方法

5.2.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內,計算兩個平板中糞腸球菌菌菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(毫升)中菌落總數結果。

5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時,按式(2)計算:

  N=∑C/（n₁+0.1n₂）×d       ...............（2）

  式中:

  N-樣品中菌落數;

  ∑C-平板(含適宜範圍菌落數的平板)菌落數之和；

  n₁-第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數；

  n₂-第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數；

  d-稀釋因子(第一稀釋度)。

6 報告

6.1 結果判定

若樣品菌落符合糞腸球菌形態學及生化鑒定的特征，可判定為糞腸球菌。

6.2 結果報告

6.2.1 定性報告

在25g(mL)樣品中檢出或未檢出糞腸球菌。

6.2.2 定量報告

菌落數小於100CFU時，以整數報告。菌落數大於或等於100CFU時,對第3位數字進行修約後，取前2位數字,後麵用0代替位數；也可用10的指數形式來表示,采用兩位有效數字。

  本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。

附：

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