標準依據：《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》
1 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。
1.1 恒溫厭氧培養箱：37±1℃。
1.2 冰箱：2-5℃。
1.3 天平：感量為0.1g。
1.4 均質器及無菌均質袋、均質杯。
1.5 振蕩器。
1.6 無菌吸管：1 mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。
1.7 無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。
1.8 無菌培養皿：直徑90mm。
1.9 顯微鏡：10倍～100倍 。
1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。
2 培養基和試劑
2.1 MRS( Man Rogosa Sharpe) 瓊脂培養基。
2.2 MRS肉湯培養基。
2.3 無菌生理鹽水。
2.4 革蘭氏染色液。
2.5 細菌生化鑒定試劑盒。
3 檢驗程序
植物乳杆菌檢驗程序見圖1。
圖1 植物乳杆菌檢驗程序
4 操作步驟
4.1 樣品製備
4.1.1 固體和半固體樣品
稱取25g樣品，置於225mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min-2min製成1：10的樣品勻液；或置於盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中，8000r/min-lO000r/min均質1min～2min製成1：10的樣品勻液。
4.1.2 液體樣品
應先將其充分搖勻後，以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，製成1：10的樣品勻液。
4.2 樣品稀釋
4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注於裝於9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1:100的樣品勻液。
4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。
4.3 培養
根據對待檢樣品菌含量的估計，選擇2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種於MRS瓊脂平板內，使用塗布棒盡可能小心快速地塗布接種液於瓊脂表麵，塗布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。塗布後，將平板靜置10min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置於37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。
4.4 菌落計數
4.4.1 選取特征菌落數在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30CFU的平板記錄具體菌落數，大於300CFU的可記錄為多不可計。 每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻。即可計算半個平板後乘以2，代表一個平板菌落數。
4.4.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。
4.5 鑒定
4.5.1 菌落挑選和純培養
挑選平板上5個邊緣透明、整齊的菌落分別轉入MRS肉湯培養基37±1℃厭氧培養箱中培養24h±2h後進行形態學、生化鑒定。
4.5.2 形態學鑒定
革蘭氏染色、鏡檢。植物乳杆菌為革蘭氏陽性杆菌，呈直杆狀，長度3.0μm～8.0μm，單個、成對或成鏈狀，通常缺少鞭毛，無芽孢。
4.5.3 生化鑒定
使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。鑒定特征見附B.1。乳杆菌屬常見菌種主要鑒別特征參見表C.1。
5 結果計算
5.1 每個平板中植物乳杆菌的數量
每個平板中植物乳杆菌菌落數的計算見式(1) :
a=b/A×C ...............（1）
式中：
a—每塊平板上的植物乳杆菌菌落數；
b—挑取後經證實為植物乳杆菌的菌落數；
A—挑取平板上用於驗證的菌落數；
C—平板上的所有特征菌落數。
5.2 菌落總數的計算方法
5.2.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內，計算兩個平板中植物乳杆菌菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克（毫升）中菌落總數結果。
5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時，按式(2)計算：
N=∑C/（n1+0.1n2）×d ...............（2）
式中：
N—樣品中菌落數；
C—平板（含適宜範圍菌落數的平板）菌落數之和；
n1—第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；
n2—第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；
d—稀釋因子（第一稀釋度）。
6 報告
6.1 結果判定
若樣品菌落符合植物乳杆菌形態學及生化鑒定的特征，可判定為植物乳杆菌。
6.2 結果報告
6.2.1 定性報告
在25g(mL)樣品中檢出或未檢出植物乳杆菌。
6.2.2 定量報告
菌落數小於100CFU時，以整數報告。菌落數大於或等於100CFU時，對第3位數字進行修約後，取前2位數字，後麵用0代替位數； 也可用10的指數形式來表示，采用兩位有效數字。
本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。
附：
GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測 點擊下載
GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測標準用到的培養基 點擊下載
上一篇：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米麵亞種）檢驗方法GB4789.29-2020
下一篇：嗜酸乳杆菌檢驗標準操作程序
