β溶血性鏈球菌的檢驗

  溶血性鏈球菌，顧名思義為有溶血作用的鏈球菌，革蘭氏陽性菌，需氧或兼性厭氧培養。鏈球菌根據其對紅細胞的溶解作用程度不一，又可分為α（甲）、β（乙）、γ（丙）三型。其中β-溶血性鏈球菌，具有完全溶血作用，其在血平板上生長產生的溶血素可在菌落在周圍形成一個2-4mm、界限分明、完全透明的無色溶血環。α-溶血性鏈球菌產生的溶血環又稱草綠色溶血，菌落周圍培養基出現1-2mm的草綠色環。γ-鏈球菌不產生溶血素，無溶血環。

  溶血性鏈球菌廣泛存在於水、空氣等自然環境及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，溶血性鏈球菌通常通過以下途徑汙染食品：①食品加工人員及其他直接接觸人員有化膿性炎症時手口鼻接觸或空氣飛沫汙染。②食品原材料帶菌，如畜禽局部化膿。③熟製品因包裝不善而使食品受到汙染。被汙染的食品會使人類通過直接接觸或皮膚、黏膜傷口等多種方式感染，危害極大，其中β溶血性鏈球菌危害最大。

  本文將按不同標準對β溶血性鏈球菌的檢驗進行介紹，以GB4789.11-2014《食品安全國家標準》為主。

一、GB4789.11-2014《食品安全國家標準》

  （1）樣品處理及增菌培養

  按無菌操作稱取檢樣25g（25mL），加入盛有225mL mTSB的均質容器（均質袋、均質杯、錐形瓶等）中，充分均質，36±1℃培養18-24h。

  mTSB對β溶血性鏈球菌進行選擇性增菌。其中多粘菌素B通過破壞細菌外膜的完整性來抑製或殺滅革蘭氏陰性菌；萘啶酮酸則通過幹擾DNA合成抑製大多革蘭氏陰性菌的繁殖；腖類提供碳源、氮源和維生素等；葡萄糖提供可發酵糖類；氯化鈉維持滲透壓；磷酸氫二鉀做為緩衝劑。此培養基不能抑製腸球菌和葡萄球菌等大多革蘭氏陽性菌，故在後續檢驗中需將其排除。

  （2）分離及純化培養

  將增菌液劃線接種於哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36±1℃厭氧培養18-24h。

  β溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA血瓊脂平板上的典型菌落為邊緣整齊圓形、灰白色、半透明、表麵光滑、有乳光凸起的的細小菌落，產生β溶血，如圖1、圖2所示。

圖1 β溶血性鏈球菌在血平板上的菌落特征

圖2 β溶血環

  此步驟是厭氧培養，是因為溶血性鏈球菌多為兼性厭氧，可在厭氧環境下生長，可減少樣品中其它專性需氧菌的幹擾。通過菌落特征可將大多有色素的球菌與β溶血性鏈球菌區分，如葡萄球菌通常為不透明菌落。β溶血環的存在與否可將不溶血或α溶血的球菌與β溶血性鏈球菌區分，如部分葡萄球菌、部分腸球菌等。

  （3）革蘭氏染色鏡檢及觸酶試驗

   1、革蘭氏鏡檢

   β溶血性鏈球菌為革蘭氏陽性、球狀或卵圓形菌，鏈狀排列且長短不一，一般為4-8個或幾十個細胞排列成鏈，無芽孢、無鞭毛、多數無莢膜。

   β溶血性鏈球菌衰老培養物染色結果為革蘭氏陰性，故應取用新鮮培養物進行染色；其在固體培養基上多為短鏈或葡萄狀，在液體中鏈狀較為典型，生長如圖3所示。

圖3 β溶血性鏈球菌在BHI中24h培養物革蘭氏染色後鏡檢結果

   2、觸酶試驗

   β溶血性鏈球菌觸酶試驗為陰性。挑取可疑菌落於潔淨的載玻片上，滴加適量3%過氧化氫溶液，立即產生氣泡者為陽性，如葡萄球菌、糖球菌；或者用玻璃棒或毛細管蘸取可疑菌落於3%過氧化氫溶液中，立即產生氣泡者為陽性，如圖4所示。

   注：此試驗必需保證純菌，不能混雜有其它菌或物質，不能直接向平板上滴加3%過氧化氫溶液。

a：β溶血性鏈球菌；b：金黃色葡萄球菌

圖4 觸酶試驗結果

   3、某些易混淆菌辨別

   ①溶血孿生球菌

   溶血孿生球菌具有革蘭氏陽性細胞壁、可厭氧生長、在血平板上產生β溶血環、觸酶陰性，易與β溶血性鏈球菌混淆。其在血平板上為透明略凸起、邊緣不規則小菌落，可與β溶血性鏈球菌區分。其革蘭氏染色為陽性但易褪色，故革蘭氏染色常見紅色紫色混合，常單個、成對或短鏈排列，成對排列時兩細胞相鄰麵扁平。

   ②β溶血的腸球菌

   腸球菌兼性厭氧、接觸酶陰性、在血平板上菌落狀態同溶血性鏈球菌相差不大（如圖5所示），革蘭氏染色液難以區分，且某些腸球菌能產生β溶血，此類腸球菌可通過補加鏈激酶試驗或40%膽汁肉湯試驗來區分。β溶血性鏈球菌鏈激酶試驗為陽性，腸球菌為陰性；40%膽汁肉湯試驗β溶血性鏈球菌為陰性（不生長澄清），腸球菌為陽性（生長渾濁），如圖6所示。

糞腸球菌	β溶血性鏈球菌

圖5 血平板劃線結果

a：空白對照；b：糞腸球菌；c：β溶血性鏈球菌

圖6 40%膽汁肉湯試驗結果

  （四）生化鑒定（選做）

   1、杆菌肽藥敏實驗

   將可疑菌落的純培養物塗布於血瓊脂平板上，用滅菌鑷子取每片含有0.04單位的杆菌肽紙片，放於塗布後的瓊脂表麵，需同時接種已知陽性和陰性菌株作為對照，於36±1℃培養24h，如有抑菌帶出現即為陽性，如圖7所示。

圖7 β溶血性鏈球菌杆菌肽藥敏實驗結果

   注：此試驗於GB/T 14926.16-2001 《實驗動物 乙型溶血性鏈球菌檢測方法》和GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》中為必做試驗。

   2、40%膽汁生長

   配製40%膽汁肉湯，接種可疑菌10-100CFU，需同時接種已知陽性菌和陰性菌作為對照，於36±1℃培養18-24h，生長即為陽性，澄清不生長即為陰性。

   注：此試驗不是必做試驗，當有些可疑菌落通過革蘭氏染色、菌落形態等難以辨別時，可選擇此試驗用以進一步鑒定。

  （五）鏈激酶試驗（選做）

  吸取草酸鉀血漿0.2mL（0.01g草酸鉀加5 mL血漿混勻，經離心沉澱，吸取上清液），加入0.8 mL無菌生理鹽水，混勻後再加入可疑菌18-24hTSB肉湯培養物0.5 mL和0.25%氯化鈣0.25 mL，混勻，置於36±1℃水浴中。待血漿凝固後（一般為10min，試管倒置不流動），繼續水浴培養24h觀察結果，若血漿完全溶解則為陽性，不溶解為陰性。β溶血性鏈球菌鏈激酶試驗為陽性。

  注：草酸鉀血漿在使用前需觀察是否變質，變質常表現為有凝塊，加入生理鹽水後不能呈完全溶解狀態，該狀態草酸鉀血漿不能使用，會影響後續結果判斷。加入可疑菌培養物和氯化鈣後應培養至血漿凝固才能繼續培養，若不能凝固則不能進行後續試驗判斷。此試驗在GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》和GB/T 14923.16-2001《實驗動物 微生物學檢驗方法》中為必做試驗。

二、關於溶血性鏈球菌的其它標準簡單介紹

  1、GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》B6溶血性鏈球菌檢驗方法：此標準中選用葡萄糖肉湯為增菌培養基，血瓊脂平板為分離純化培養基。鏡檢為革蘭氏陽性鏈狀排列球菌、血平板上出現溶血圈、鏈激酶和杆菌肽試驗陽性，可報告檢出溶血性鏈球菌。

  2、GB/T 18204.3-2013《公共場所衛生檢驗方法》第3部分：空氣微生物β-溶血性鏈球菌：鏡檢、菌落特征符合描述，有β溶血環即可判定為β溶血性鏈球菌。注意此標準中血平板培養時間為24-48h。

  3、GB/T 14923.16-2001《實驗動物微生物學檢驗方法》乙型溶血性鏈球菌檢測方法：菌落特征和鏡檢菌體特征符合描述、鏈激酶試驗陽性、杆菌肽敏感試驗陽性，可報告檢出乙型溶血性鏈球菌。

  4、SN/T 4624.5-2016《入境環保用微生物菌劑檢測方法》第5部分：β型溶血性鏈球菌：此標準從增菌到分離純化到形態學及生化鑒定與GB4789.11-2014《食品安全國家標準》無明顯區別，具體可參照國標介紹。

  5、DB15/T 2071-2021《內蒙古自治區地方標準》動物墊料中β-溶血性鏈球菌檢測：此標準從增菌到分離純化到形態學及生化鑒定與GB4789.11-2014《食品安全國家標準》無明顯區別，具體可參照國標介紹。

  6、SN/T 2754.9-2011《出口食品中致病菌環介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法》第9部分：溶血性鏈球菌。

  注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。

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