一、樣品處理及增菌
1.樣品的處理
以無菌操作取樣25g（mL）加入裝有滅菌225mL誌賀氏菌增菌肉湯的均質容器中，常用均質容器有均質杯、錐形瓶、均質袋。如圖1-1。
a均質袋；b錐形瓶
圖1-1均質容器
均質杯多用於不易溶解的固體樣品均質，可將固體樣品切割攪拌均勻；均質袋可置於拍擊式均質器中均質固體，也常用於液體的均質；錐形瓶可置於搖床中，常用於液體的均質。
2.增菌
均質後的樣品置於41.5℃±1℃，厭氧培養16h-20h。厭氧培養可使用厭氧培養箱、厭氧培養盒和厭氧培養袋（如圖1-2-1）等。
a均質袋在厭氧袋中培養；b錐形瓶在厭氧袋中培養
圖1-2-1厭氧袋培養
誌賀氏菌在誌賀氏增菌肉湯中生長渾濁，如圖1-2-2所示。
a空白管；b福氏誌賀氏菌ATCC12022；
c宋內誌賀氏菌ATCC25931；d痢疾誌賀氏菌CMCC51252
圖1-2-2
二、誌賀氏菌的分離
取增菌後的誌賀氏增菌液分別劃線接種於XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或誌賀氏顯色培養基平板上，於36℃±1℃需氧培養20h-24h。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續培養至48h再進行觀察。
1.XLD瓊脂平板
誌賀氏菌在XLD瓊脂平板上的菌落特征為粉色至無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-1所示）。誌賀氏菌大多不發酵木糖、乳糖和蔗糖，可與發酵此三種糖類的細菌（如大腸黃色菌落）區分；誌賀氏菌不產硫化氫，可與產硫化氫的細菌（如大部分沙門等）區分。
a福氏誌賀氏菌ATCC12022；b宋內誌賀氏菌ATCC25931；c痢疾誌賀氏菌CMCC51252
圖2-1誌賀氏菌在XLD瓊脂平板上的生長情況
2.MAC或誌賀顯色培養基
誌賀氏菌在MAC瓊脂平板上的菌落特征為微黃色菌落，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-2-1所示）。誌賀氏菌大多不發酵乳糖產堿，故菌落顏色為黃色，可與發酵乳糖產酸（菌落顏色為紅色，或有膽鹽沉澱環）的細菌區分。部分宋內誌賀氏菌遲緩發酵乳糖，若培養時間過長會產生粉色菌落，混淆結果。
a福氏誌賀氏菌ATCC12022；b宋內誌賀氏菌ATCC25931；c痢疾誌賀氏菌CMCC51252
圖2-2-1誌賀氏菌在MAC瓊脂平板上的生長情況
誌賀氏菌在誌賀氏顯色培養基平板上的菌落特征為白色或無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落（如圖2-2-2所示），有些宋內誌賀氏菌有藍色中心。
a福氏誌賀氏菌ATCC12022；b宋內誌賀氏菌ATCC25931；c痢疾誌賀氏菌CMCC51252
圖2-2-2誌賀氏菌在誌賀氏顯色培養基平板上的生長情況
三、初步生化試驗
自上述選擇性平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂（TSI）、半固體和營養瓊脂斜麵一管，置於36℃±1℃需氧培養20h-24h。
1.三糖鐵瓊脂
誌賀氏菌在三糖鐵瓊脂TSI中：
①斜麵產堿呈紅色且底層產酸呈黃色（發酵葡萄糖，不發酵乳糖、蔗糖），如圖3-1-b、c、d；
②不產氣（福氏誌賀氏菌6型可產生少量氣體），可對比圖3-1-e產氣結果進行判斷；
③不產硫化氫，可對比3-1-f產硫化氫（可觀察到黑色）結果進行判斷。
a空白管；b福氏誌賀氏菌ATCC12022；c宋內誌賀氏菌ATCC25931；
d痢疾誌賀氏菌CMCC51252；e大腸埃希氏菌ATCC25922；f沙門氏菌ATCC14028
圖3-1誌賀氏菌在TSI瓊脂斜麵上的生長情況
2.半固體培養基
誌賀氏菌在半固體培養基中無動力，如圖3-2-b、c、d所示，3-2-e、f為有動力菌株實驗結果。
a空白管；b福氏誌賀氏菌ATCC12022；c宋內誌賀氏菌ATCC25931；d痢疾誌賀氏菌CMCC51252
e大腸埃希氏菌ATCC25922；f沙門氏菌ATCC14028
圖3-2誌賀氏菌在半固體瓊脂上的生長情況
誌賀氏菌在半固體培養基中無動力，隻沿穿刺線生長；對比之下，大腸埃希氏菌和沙門氏菌在半固體培養基中有動力，在培養基中擴散生長，觀察培養基會發現穿刺線周圍呈現“混濁”狀態。
四、後續鑒定
確定符合TSI和半固體培養基中誌賀氏菌生化反應結果的可疑菌落，挑取其在已培養的營養瓊脂斜麵上生長的菌苔，進行後續生化實驗和血清學鑒定。
五、注意事項
1、取檢樣時應保證無菌操作，避免引入汙染：①取樣工具（藥匙、槍頭等）、均質容器無菌處理；②取樣操作、後續接種操作在無菌環境中進行。
2、在選擇均質容器時，除了要考慮均質容器的功能性，還要兼顧後續的厭氧培養條件能否實現。如果配備厭氧培養箱，則可自由選擇均質容器；若隻能使用厭氧培養盒或厭氧培養袋，則需考慮到均質容器的大小等，以確保厭氧增菌能正常進行。
3、使用誌賀氏增菌肉湯增菌時，需注意培養溫度為41.5℃±1℃且厭氧培養，主要是因為誌賀氏菌在此條件下並在含有低濃度碳水化合物的培養基中生長速度超過大腸菌群，以及誌賀氏菌在提高溫度時對新生黴素相對耐受。
3、TSI培養基要製成高層斜麵，便於後續試驗觀察，高層斜麵是指斜麵與底層高度約2:3，即底部高約3cm，斜麵長度2cm。
4、在進行半固體瓊脂穿刺試驗時，接種針不是總能沿穿刺路徑原路返回，導致穿刺路線會側向擴大。進行結果觀察時需注意，半固體培養基的陽性結果是穿刺線周圍的培養基會呈現“混濁”狀態，即有菌的運動和生長，不是單純的側向擴增。
5、部分不產硫化氫的沙門氏菌是誌賀氏菌分離鑒定過程中的幹擾菌，其在XLD、MAC和誌賀氏顯色培養基上生長狀態類似，需繼續進行後續實驗才能將其區分。
注：本文依據《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準 食品微生物檢驗 誌賀氏菌檢驗》
注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。
下一篇：肺炎克雷伯氏菌檢驗
