有關BS瓊脂平板上產生黑渣問題的探討

一、背景簡介

  沙門氏菌很容易引起中毒，人一旦攝入含有大量沙門氏菌的動物性產品，就會引起細菌性感染，進而在毒素作用下發生食物中毒。肉、蛋以及食品從加工到出售的過程中都十分容易發生沙門氏菌的傳播汙染， 禽沙門氏菌可以引起禽白痢、傷寒、副傷寒等疾病, 並汙染食物, 造成人類食物中毒。因此對沙門氏菌檢測事關重大。

  亞硫酸鉍瓊脂培養基，簡稱BS瓊脂，主要用於沙門氏菌的檢測。在《GB4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》中，這是一款必須用到的培養基。

  沙門氏菌檢驗程序見圖一。

圖一

  關於BS瓊脂，具體可參考文章：亞硫酸鉍瓊脂（BS）原理和使用方法 。

二、麵臨的問題

  在實際配製使用過程中，經常會有實驗人員反饋，這種培養基製成的平板底部有黑渣，並且盛放培養基的搪瓷缸底部也會有很多黑渣沉澱，有的人甚至懷疑是培養基原料沒有溶解或者培養基本身有雜質所致。本文主要就這一問題做一探討。

三、原因探究

  首先，來看該培養基的配方，成分(g/L)。

蛋白腖	10.0
牛肉浸粉	5.0
葡萄糖	5.0
硫酸亞鐵	0.3
磷酸氫二鈉	4.0
煌綠	0.025
檸檬酸鉍銨	2.0
亞硫酸鈉	6.0
瓊脂	20.0
pH值7.5±0.2	25℃

  在這個配方列表中，除了煌綠顏色較深之外，並沒有任何黑色或棕色的物質，而在溶解過程中，煌綠能溶解於水，不會形成黑色不溶物。至於牛肉粉、蛋白腖、葡萄糖和磷酸氫二鈉，都是一些常規營養物質，也不會產生沉澱。硫酸亞鐵、檸檬酸鉍銨、亞硫酸鈉分別都是能溶於水的物質，單純溶解每一種試劑，均不會有任何雜質沉澱。那麽黑色的沉渣到底從何而來？其實，配方中的這幾種成分都沒有問題，問題就在於把這些物質混合到一起溶解，加熱的過程中發生了複雜的化學反應所致。

  檸檬酸鉍銨在水熱過程中能分解出NH₄⁺，檸檬酸根在水熱過程中分解產生CO₃^2-，部分Bi³⁺被還原成Bi單質；金屬Bi呈粉紅色；硫酸亞鐵中的Fe²⁺也可能形成Fe³⁺等形式。這些離子之間相互反應，不可避免地產生了一些帶顏色的沉澱物。

四、問題解決

  下麵再來看一下，GB4789.4-2016中對該培養基配製方法的敘述：

  將前三種成分加入300mL蒸餾水(製作基礎液)，硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。然後分別攪拌均勻,煮沸溶解。冷至80℃左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎液中，混勻。

  將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎液中，再混勻。調節pH至7.5±0.2，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50℃～55℃。加入煌綠溶液，充分混勻後立即傾注平皿。

  標準中，之所以將不同的成分分組溶解，按照一定的條件和順序混合，就是為了避免或減少這些成分之間相互反應，形成不溶物。實際使用過程中，為了使用的方便，通常將培養基成分進行混合，形成幹粉混合物，再根據需要製成平板使用。這就不可避免地會使傾注的平板上自帶黑渣。那麽這些黑渣的存在對實驗效果有沒有影響？又怎樣能將這種影響盡量降低呢？下麵我們來看一組實驗：

  首先，在室溫條件下，按比例配製200mlBS培養基，充分攪拌，使裏麵的成分溶解完全，然後按照常規方法加熱煮沸滅菌，加熱過程中不斷攪拌，避免粘底糊化，冷卻至50℃-55℃，不再做任何攪拌，直接依次傾入10個平皿並編號。傾倒時會發現，開始的幾個平板黑渣較少，越往底部，黑渣越多，最後再搪瓷缸底部會沉澱下大量的黑色不溶物。如圖二：

圖二

  傾倒出的平板上有明顯黑渣，如圖三：

圖三

  將沙門氏菌在製好的平板上進行劃線、培養，會發現，開始傾倒的幾個平板上，3區都能長出，且菌落直徑較大，而最後傾注的平板上，沙門氏菌的生長明顯受到影響，且菌落直徑偏小。如圖四：

圖四

  作為對比試驗，傾倒的過程中，不斷攪拌，傾注成的平板就會比較均勻，搪瓷缸底物幾乎沒有黑渣沉澱下來，其實這個道理很簡單，就是在攪拌的過程中，將原本形成的黑色不溶物均勻地分散到所有平皿中去了。倒出的平皿如圖五：

圖五

  沙門氏菌在這一組平板上的生長特征基本一致，沒有明顯差別。如圖六：

圖六

  通過上麵的試驗，我們可以看到，隻要在傾倒平板的過程中持續進行攪拌，傾倒完畢，搪瓷缸底部就不會有很多黑渣，並且倒出的平板沒有黑渣聚集的現象。沙門氏菌的生長也比較均一。對菌落的影響不明顯。不影響培養基的使用。

  在使用過程中，隻要把握“均勻攪拌”這一原則，就可以很好地使用這款培養基，而不能一味糾結於平板上的黑渣。因為這是不可避免的。

五、注意事項

  GB4789.4中特別指出，本培養基不需要高壓滅菌,在製備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性,貯於室溫暗處,超過48h會降低其選擇性,本培養基宜於當天製備,第二天使用。

  對此，分別用放置24h和當天配製的BS平板進行劃線試驗對比，結果如圖七：

圖七

  從圖中可以看出，放置24h後使用，劃線菌落明顯比當天配製當天使用長得好一些，現配現用，由於抑製性太強，容易導致有些目標菌生長不出來，造成漏檢。

  有關目標菌的生長對比，還可以參考：亞硫酸鉍瓊脂配置後不同使用時間目標菌的生長對比。

六、參考文獻

  [1] GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗。

  [2] 高廣堯，開麗紅 禽沙門氏菌的危害及控製。

  [3] 董興安，雄偉，遇麗  N 摻雜Bi2O2CO3/氧化石墨烯分級結構的合成及其可見光催化性能研究。

  注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。

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