一、參考標準：
《GB4789.29-2020食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米麵亞種）檢驗》。
二、菌種特征：
1、生物學特性：
革蘭氏陰性杆菌，長2.5-3μm，寬0.5-1.0μm，呈杆狀、球杆狀或稍彎曲，兩端鈍圓，無芽胞，有鞭毛。本菌為兼性厭氧，但易在表麵生長。最適生長溫度為37℃，最適產毒溫度為26℃。pH 5-7範圍內生長較好。
2、流行病學特點：
椰毒假單胞菌酵米麵亞種（Psedomonas cocovenenans subsp.farino fermentans)是我國發現的一種食物中毒菌，為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）的一個病原型。它存在於發酵的玉米、糯玉米、黃米、高梁米、變質銀耳以及周圍環境中，它是酵米麵及變質銀耳中毒的病原菌。該菌產生的毒素米酵菌酸是其致病原因。該食物中毒的主要症狀，開始患者感到上腹部不適，少數出現腹瀉、惡心、嘔吐，嘔吐物多為咖啡色，嚴重者出現黃疸、昏迷、四肢抽搐、少尿、血尿、便血和尿瀦留，呈現休克而死亡。目前尚無特效的治療辦法。
三、培養基原理分析及結果：
1、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（mPDA）（點擊此查看培養基詳情）
原理：馬鈴薯為微生物的生長提供各類氮源、碳源、維生素，葡萄糖提供能源，瓊脂是培養基的凝固劑，氯黴素可抑製細菌的生長，龍膽紫抑製真菌的生長。
結果：培養24 h後，菌落1 mm-2 mm，紫色，光滑、濕潤、邊緣整齊；培養48h後，部分菌落中心可有呈草帽狀凸起。如圖一。
圖一 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h
原理：PCFA培養基基礎中的氯化銨為微生物的生長提供氮源；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉是緩衝劑；氯化鈉可維持細胞滲透壓；氯化鈣、硫酸鎂和硫酸亞鐵為微生物生長提供微量元素；葡萄糖和胱氨酸用於唐菖蒲伯克霍爾德氏菌代謝酶的合成；衛矛醇可為微生物生長提供碳源；瓊脂是培養基凝固劑。配套添加劑可抑製大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性杆菌生長，同時也可抑製大部分革蘭氏陽性球菌的生長。
結果：培養24 h後，菌落0.5 mm-1 mm，灰白色，光滑、濕潤、邊緣整齊。如圖二。
圖二 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h
3、卵黃瓊脂
原理：蛋白腖和牛肉粉提供碳氮源、維生素和生長因子；葡萄糖提供能源；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養基的凝固劑；具有卵磷脂酶的細菌可分解卵磷脂生成不溶性甘油酯，從而形成乳白色的混濁帶。
結果：培養24 h後，菌落2 mm-3 mm，表麵光滑、濕潤；培養48 h後，菌落周圍形成乳白色混濁環，斜射光下可見菌落及周圍培養基表麵呈虹彩現象。如圖三。
圖三 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248培養48h
四、生化鑒定原理及結果分析：
1、革蘭氏染色
試驗所用試劑：革蘭氏染色液試劑盒。
原理：革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此，能把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料複染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
結果：革蘭氏陰性，菌體呈短杆狀，單個或成對排列。如圖四所示。
圖四
2、氧化酶試驗
試驗所用試劑：氧化酶試紙。
原理：氧化酶即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶係統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然後此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。在 30s內變為藍色或藍紫色為強陽性，2min內不變色為陰性。
結果：不變色，為陰性。如圖五
圖五 左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248 右：銅綠假單胞菌ATCC9027
3、尿素酶試驗
試驗所用試劑：尿素酶生化管。
原理：有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解、產生氨，使培養基變堿呈粉紅色。
結果：培養基變為粉紅色，為陽性。如圖六。
左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248 右：大腸埃希氏菌ATCC25922
圖六
4、檸檬酸鹽利用試驗
試驗所用培養基：西蒙氏枸櫞酸鹽培養基。
原理：西蒙氏枸櫞酸鹽培養基中氯化鈉維持均衡的滲透壓，鎂離子是各種代謝中的輔因子，磷酸二氫銨提供氮源，磷酸氫二鉀是緩衝劑，檸檬酸鈉作為碳源，瓊脂是培養基的凝固劑，溴麝香草酚蘭為pH 指示劑。當細菌可以利用銨鹽作為唯一的氮源，同時利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源時，可在檸檬酸鹽培養基上生長，分解檸檬酸鈉，生成碳酸鈉，使培養基產堿變藍色。
結果：培養基變藍，為陽性。如圖七。
左：大腸埃希氏菌ATCC25922 右：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248
圖七
5、石蕊牛奶試驗
試驗所用培養基：石蕊牛奶培養基。
原理：牛奶中含有乳糖以及三種主要的蛋白質，即酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白。在石蕊牛奶培養基中，微生物可能表現出一種或幾種代謝特性，每一種特性專屬於特定 菌種，可以輔助細菌的鑒定。這些代謝特性包括乳糖發酵、石蕊還原、凝乳產生、腖化（蛋白消化）和產氣。石蕊是良好的酸堿指示劑，自身的氧化還原特性及對細菌的低毒性（相對於溴甲酚紫）使得石蕊成分十分有用的牛奶培養基指示劑。
結果：頂部淡紫色，底部乳白色。如圖八。
左：空白對照 右：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248
圖八
6、靛基質試驗
試驗所用培養基、試劑：蛋白腖水（色氨酸肉湯）、Kovacs靛基質試劑。
原理：蛋白腖為微生物的生長提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；含有色氨酸酶的細菌，能分解蛋白腖中的色氨酸，形成靛基質（吲哚），靛基質無色，當加入對氨基苯甲酸試劑後，形成可見的紅紫色醌式化合物，即玫瑰靛基質。
結果：滴加Kovacs靛基質試劑後產生黃色環，為陰性。如圖九
左：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌ATCC10248 右：大腸埃希氏菌ATCC25922
圖九
注：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌其它生化特征見下表。
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生化試驗 |
特征 |
|
O/F試驗（氧化型） |
＋ |
|
氧化 |
|
|
葡萄糖 |
＋ |
|
果糖 |
＋ |
|
木糖 |
＋ |
|
半乳糖 |
＋ |
|
蔗糖 |
－ |
|
阿拉伯糖 |
＋ |
|
甘露醇 |
＋ |
|
側金盞花醇 |
＋ |
|
肌醇 |
＋ |
|
衛茅醇 |
＋ |
|
動力 |
＋ |
|
卵磷脂酶 |
＋ |
|
氧化酶 |
－ |
|
尿素 |
＋ |
|
明膠液化 |
＋ |
|
硝酸鹽還原 |
＋ |
|
檸檬酸鹽利用 |
＋ |
|
精氨酸 |
＋ |
|
石蕊牛乳 |
＋ |
|
靛基質 |
－ |
|
V-P |
－ |
|
MR |
－ |
|
苯丙氨酸脫氨酶 |
－ |
|
H2S產生 |
－ |
|
注：＋表示陽性；－表示陰性。 |
|
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