革蘭氏染色是一項經典的細菌鑒別手段，自19世紀80年代丹麥的醫師GRAM創立起，至今已經近一個半世紀，仍舊在細菌的檢測和鑒定分類上被廣泛應用著。在我國，GB 4789係列的國標中很多致病菌的檢測也都需要進行革蘭氏染色，可見其重要性。甚至可以說沒有精準掌握革蘭氏染色的微生物檢驗員，不會是一個合格的檢驗員。
革蘭氏染色原理
細菌先經堿性染料結晶紫染色，而後經碘液進行媒染，之後用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染後的顏色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),後者為革蘭氏陰性菌(G-)。為方便進一步觀察，脫色後可再用一種紅色染料如堿性番紅等進行複染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被重新染上紅色。有芽孢的杆菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌、螺旋體和大多數致病性的無芽孢杆菌都呈現負反應。
細菌細胞通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料複染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
革蘭氏染色法一般步驟
1.塗片固定。在幹淨的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液並塗布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數過多聚集成團，不利於觀察細菌個體形態，可在載玻片一側進行上述操作，而在另一側再加一滴水，從已塗布的菌液中再取一環於此水滴中進行稀釋，塗布成薄層。若材料為液體培養物或固體培養物中洗下製備的菌液，則直接塗布於載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進行一次稀釋。
塗片最好在室溫條件下使其自然幹燥，有時為了使之幹得更快些，可將標本麵向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
標本幹燥後即進行固定，固定的目的有三個：(1)殺死微生物，固定細胞結構。(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水衝洗掉。(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端(塗有標本的遠端),標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2s-3s,並不時以載玻片背麵加熱，載玻片背麵觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷後，再進行染色。
2.染色。在固定過的塗片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個菌膜，染色1min。
3.水洗。染色到一定的時間，拿住玻片使之成45度角，用細小的水流把多餘的染料衝洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
4.媒染。加碘液覆蓋塗麵染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。
5.水洗。用細小的水流緩慢衝洗塗片上的染色液，用吸水紙吸幹。
6.脫色。加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20s-30 s後再進行水洗，吸去水分。
7.複染。蕃紅染色液染色10 s後， 自來水衝洗。
8.幹燥。染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。
影響染色結果準確性的關鍵因素：
1.試劑影響。這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期後的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功最基礎的一環。
2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我們染色過程中選擇的菌應該是處於活躍生長期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結果準確度高，一般情況下不會出現誤差。培養時間較長的革蘭氏陽性菌，由於細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會呈現出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經統計過培養至不同時間的金葡的革蘭氏染色結果，結果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結果的準確率基本可以達到100%，而超過26h之後，準確率就開始下降，培養至36h時，準確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處於活躍期、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴格的在國標要求的時間段內進行染色試驗，不能提前或者延後。
3.塗菌的狀態。在染色最初的塗布中，在挑取菌體後應該在無菌水上塗成薄薄的菌膜。而在塗布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結果的準確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產生假陽性的結果。同時，在初染、媒染及複染的過程中，應將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在塗片過程一定要將菌膜塗得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。
4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由於媒染時間過長，結晶紫在碘液長時間作用下過分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控製在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過60s準確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控製在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是一個對結果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結構，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細菌細胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結晶紫及碘複合物就很快被酒精洗脫，之後就會被沙黃複染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精隻能起到脫水效果而無法進入，這樣結晶紫和複合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導致陰性菌菌體內的結晶紫和複合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現明顯的誤差，使陰性菌出現假陽性。而洗脫時間過長，也會導致陽性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內的紫色被洗脫，呈現假陰性。因此洗脫時間也是革蘭氏染色的關鍵環節。洗脫時間應當嚴格控製在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。
總結一下，在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控製的幾個方麵：染色菌必須是在其活躍期內，塗布狀態不可太厚，媒染時間嚴格控製在50s-60s之間，脫色時間嚴格控製在20s-30s。把握以上的關鍵控製點，革蘭氏染色基本就不會出現問題啦！
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