益生菌活菌計數方法現狀
隨著益生菌功能研究的深入，益生菌越來越多地應用於食品和保健食品中，“ 活菌數”是保證其相關產品質量的一個關鍵指標。提高益生菌活菌計數方法的準確性和穩定性，可以為企業生產過程中對益生菌相關產品質量的控製、提升食品質量安全水平提供技術支撐，同時可以更好地應用於監管部門的專項抽查、風險監控、執法檢驗等活動中。
目前較普遍使用的益生菌活菌計數方法是參照國家標準GB 4789.35-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。
食品用乳酸菌主要分為兩大類:一類是食品加工用乳酸菌;第二類是具有健康功能的活的乳酸菌，又稱益生菌。與食品加工用乳酸菌特征指標不同的是，益生菌產品的活菌數通常都很高，可達到100億至1000億以上，而冷凍幹燥菌粉原料中活菌數甚至可達到1000億至10000億，且生產日活菌添加量與保質期內活菌穩定性通常是益生菌產品最關鍵的質量標準和功效指標，也是衡量益生菌原料與終端產品市場價值最核心與關鍵的因素。現行國標在實際應用中發現，進行高活菌密度、某些特殊劑型及配方或含有某些新菌種的益生菌產品的活菌計數時，常常出現結果不穩定或檢驗結果明顯低於生產時活菌添加量的情況。
影響計數結果最主要的影響因素包括稀釋液和計數培養基。樣品稀釋時，三個因素對活菌的準確計數影響最大:稀釋比例、稀釋液組成和pH值。綜述前人的研究經驗(2):樣品製備的稀釋比例為1:5-1:10 ;稀釋後樣品懸液的pH值最好與最佳生長pH值-致;因益生菌具有氧敏感性,稀釋液中應該含有抗氧化劑。日本研究者Masamichi MUTO和Fumiaki ABE等(2010年)在研究了多種稀釋液配方後認為，Mitsuoka' s緩衝液適用於含有嚴格厭氧的雙歧杆菌活菌產品的稀釋，該緩衝液含有磷酸鹽、半胱氨酸和吐溫80,前2個成分分別具有緩衝能力、抗氧化能力，而吐溫80則可改善產品在稀釋液中的分散能力。(3)目前國標方法選用的培養基如下:以MRS瓊脂(厭氧)為總乳酸菌計數培養基;在含有多菌種的產品中，以添加有莫匹羅星抗生素的MRS瓊脂(厭氧)作為雙岐杆菌選擇性計數培養基，以MC瓊脂(需氧)為嗜熱鏈球菌選擇性計數培養基，以總乳酸菌數減去雙歧杆菌和嗜熱鏈球菌數為乳杆菌數。但是,近年來,綜述多個研究結果(2, 3)，RCM培養基可提高冷凍幹燥雙歧杆菌的活菌計數準確性。
此外，本實驗室多年來采用GB 4789 .34-2003《食品衛生微生物學檢驗雙岐杆菌檢驗》中推薦的TPY瓊脂培養基用於乳酸菌的計數，發現其用於益生菌產品的活菌計數結果較穩定。
為此，本研究比較了兩種稀釋液及幾種計數培養基對兩類代表性益生菌產品(冷凍幹燥活菌粉原料和益生菌顆粒產品)活菌計數結果的影響，以確定更符合益生菌產品特點的活菌計數方法。
材料和方法
試劑及培養基
生理鹽水; Mitsuoka' s緩衝液(6.0g Na2HPO, 4.5 g KH2PO,，0.5g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5g吐溫80，1000mL蒸餾水);MRS瓊脂、TPY瓊脂(青島betway必威西汉姆联) ; RCM瓊脂(OXOID)。改良MRS、改良TPY和改良RCM瓊脂分別為添加有50μg/ml莫匹羅星鋰鹽(青島betway必威西汉姆联)。
樣品
所用樣品為嗜酸乳杆菌LA11-ONLLY冷凍幹燥活菌粉(3000億CFU/g)、長雙歧杆菌BL88-ONLLY冷凍幹燥活菌粉(3000億CFU/g)和昂立1號益生菌顆粒(國食健字G20060027)產品，均來自上海交大昂立股份有限公司，各選取三個批號的樣品進行平行檢驗。
實驗方法
稱取2.00g士0.01g樣品，分別至18ml生理鹽水或Mitsuoka' s緩衝液中，均質1 min,靜置5 min,分別用生理鹽水或Mitsuoka's緩衝液梯度稀釋至合適濃度。
乳杆菌菌粉計數
以MRS、TPY瓊脂培養基，分別置於37°C厭氧、好氧條件下培養48-72小時，比較不同稀釋液和培養基對計數結果的影響。
雙歧杆菌菌粉計數
以MRS、TPY和RCM瓊脂培養基，分別置於37°C厭氧培養48-72小時，比較不同稀釋液和培養基對計數結果的影響。
冷凍幹燥活菌粉的計數結果
乳杆菌冷凍幹燥菌粉
由於乳杆菌為兼性厭氧菌，在好氧和厭氧條件下均可生長，本研究以生理鹽水或Mitsuo-ka’s緩衝液為菌粉稀釋液，以MRS或TPY為培養基,分別在好氧和厭氧進行培養。三批嗜酸乳杆菌LAI1-ONLLY菌粉采用不同方法計數的結果見表1和圖1。
從結果看出，培養方式對計數結果影響很小;而稀釋液對計數結果有顯著影響。用生理鹽水稀釋和用Mitsuoka's緩衝液稀釋後計數結果分別為3.95×1011cfu/g
和4.47×1011cfu/g，用生理鹽水作為稀釋液可檢出的活菌僅為Mitsuoka' s緩衝液的87%。
雙歧杆菌冷凍幹燥菌粉
雙歧杆菌與乳杆菌不同，為嚴格厭氧菌，僅在厭氧條件下生長。分別考察兩種稀釋液和三種培養基對長雙歧杆菌BL88-ONLLY菌粉計數結果的影響，結果見表2。
從表2結果可見，菌粉稀釋液和培養基均對計數結果產生了顯著影響，Mitsuoka' S緩衝液與RCM瓊脂組合檢出的活菌數最高，以此為100%，那麽Mitsuoka' s緩衝液與MRS和TPY組合的計數結果分別為36%和98%;而用生理鹽水，MRS、TPY和RCM計數結果僅分別25%、76%和78%，生理鹽水作為稀釋液對活菌細胞影響較大，會影響計數結果。
益生菌顆粒計數結果
稀釋液對pH值的影響
對昂立1號‘益生菌顆粒連續3個批號，分別采用生理鹽水和Mitsuoka'S緩衝液溶解並測定pH值，結果見表3。生理鹽水稀釋液pH值為4.41,而Mitsuoka' s緩衝液組的為6.56。可見，稀釋液對樣品勻液的pH值影響較大。
益生菌顆粒總乳酸菌計數
采用生理鹽水和Mitsuoka’s緩衝液進行樣品稀釋，分別以MRS、TPY和RCM厭氧培養進行總乳酸菌計數，結果見表4。Mitsuoka' s緩衝液與RCM組合的計數結果記為100%，則MRS和TPY的結果分別為85%和98%，而用生理鹽水時三種培養基結果分別為60%、74%和72%，這表明，MRS用於乳杆菌和雙歧杆菌複配產品的總乳酸菌計數時，結果偏低，Mitsuoka’s緩衝液、TPY和RCM培養基厭氧培養更適用於本產品中總乳酸菌計數。
益生菌顆粒長雙歧杆菌選擇性計數
用Mitsuoka' s緩衝液溶解後，以改良MRS、改良TPY和改良RCM厭氧培養，並與國標比較，結果見表5。以改良RCM結果為100%,改良TPY結果為96%左右，而改良MRS結果隻有71%左右。可見，MRS不適於長雙歧杆菌的活菌計數，RCM或TPY更適合。國標方法(生理鹽水/改良MRS培養基)的計數結果僅為59%左右，推薦使用Mitsuoka' S緩衝液、改良TPY或改良RCM培養基厭氧培養進行益生菌顆粒產品長雙歧杆菌選擇性計數。
益生菌顆粒嗜酸乳杆菌選擇性計數
用國標方法(生理鹽水/ MRS厭氧培養總數減去改良MRS厭氧培養數)、Mitsuoka' s緩衝液/MRS/好氧培養、Mitsuoka' s緩衝液/TPY/好氧培養方法進行選擇性計數，結果見表6。以Mitsuoka' S緩衝液/TPY/好氧培養方法計數結果為100%,Mitsuoka' S緩衝液/MRS/好氧培養結果約為95%，而國標方法結果僅為55%。根據本實驗結果，推薦使用Mitsuoka’s緩衝液、MRS或TPY好氧條件下進行益生菌顆粒中嗜酸乳杆菌選擇性計數。
討論
推薦用於冷凍幹燥活菌粉的稀釋液和培養基。稀釋液對結果的影響可能是由於高密度菌粉本身呈酸性，若菌粉稀釋液呈酸性，可能會對細胞造成傷害，而Mitsuoka's緩衝液添加了磷酸鹽作為緩衝體係以及吐溫80作為細胞膜表麵活性劑，可以保護細胞在溶解複水過程中免受損害。經過本實驗，推薦Mitsuoka' S緩衝液作為冷凍幹燥活菌粉的菌粉和梯度稀釋液;推薦MRS和TPY瓊脂好氧培養用於乳杆菌冷凍幹燥活菌粉的計數;推薦TPY和RCM瓊脂厭氧培養用於雙歧杆菌冷凍幹燥活菌粉的計數。
推薦用於益生菌產品的稀釋液和培養基。Mitsuoka's緩衝液比生理鹽水更適合用於該活菌產品的稀釋。益生菌顆粒為乳杆菌與雙歧杆菌及其它輔料複配而成的產品。本研究推薦用TPY或RCM在厭氧條件下檢驗總乳酸菌數，采用MRS或TPY在好氧條件下檢驗嗜酸乳杆菌數，采用以莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM在厭氧條件下檢驗長雙歧杆菌數。
結論
通過比較研究，發現Mitsuoka' s緩衝液更適用於益生菌活菌樣品溶解與梯度稀釋。對乳杆菌活菌粉，推薦采用MRS或TPY於好氧或厭氧條件下計數;對雙歧杆菌活菌粉，推薦采用TPY或RCM於厭氧條件下計數;對乳杆菌和雙歧杆菌混合複配產品，推薦采用TPY或RCM於厭氧條件下進行總乳酸菌計數，采用莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM於厭氧條件下進行雙歧杆菌選擇性計數，采用MRS或TPY於好氧條件下進行嗜酸乳杆菌選擇性計數。
本文轉載自上海交大昂立股份有限公司 張旻 杭曉敏
