大腸杆菌是食品汙染程度的重要參數指標，是反應食品質量的必測項目，因此，很好地掌握其檢測方法以及在檢測全過程中的常見問題及解決辦法是每一個食品檢測人都應該具備的技能。
大腸菌群(Coliform bacteria)是指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌。該菌主要來源於人畜糞便，故以此作為糞便汙染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中是否有汙染腸道致病菌的可能。大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界中廣泛存在。
調查研究表明，大腸菌群多存在於溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便汙染的地方。人、畜糞便對外界環境的汙染是大腸菌群在自然界存在的主要原因之一，糞便中多以典型大腸杆菌為主，而外界環境中則大腸菌群的其他菌株較多。
一、檢測方法
大腸菌群檢測的關鍵在於方法的選用，食品中大腸菌群檢測有兩種表示方法，其一是以100mL(g)檢樣內大腸菌群最大可能數(MPN)表示，檢測方法需使用GB/T 4789.3-2003《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》；其二以每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值表示，檢測方法需使用GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》。GB/T 4789.3-2003《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定》雖然被後更新的方法代替，但衛生部關於規範食品中大腸菌群指標的檢測工作公告(2009年 第16號)明確指出，為規範食品中大腸菌群指標的檢測工作公告如下：
現行食品標準中規定的大腸菌群指標以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定》(GB/T 4789.3-2003)進行檢測;以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”為單位的，適用《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群計數》(GB/T4789.3-2008)進行檢測。後GB/T 4789.3-2008被GB 4789.3-2016替代，故檢測樣品前需根據產品標準認真選擇方法。
例如，GB/T2717-2003醬油衛生標準中對大腸菌群的要求需使用方法一GB/T 4789.3-2003。又如GB/T 2718-2014醬油衛生標準中對大腸菌群的要求需使用方法二GB4789.3-2016。
MPN檢索表使用
GB/T 4789.3-2003檢索表中陽性管數是以1mL(g)×3、0.1mL(g)×3和0.01mL(g)×3的梯度進行表示，GB 4789.3-2016陽性管數是以0.10、0.01和0.001的梯度表示,均按照稀釋倍數推算結果，結果相同。推算方法以GB 4789.3-2016為例，改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表內數字應相應降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時,則表內數字應相應增高10倍,其餘類推即可。
二、常用標準
1、GB/T 4789.3-2003食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定
2、GB 4789.3-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數
3、GB 4789.28-2013食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求
4、GB 4789.1-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則
5、GB 4789.41-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸杆科檢驗
6、GB/T 27405-2008實驗室質量控製規範 食品微生物檢測
7、GB/T 16294-2010醫藥工業潔淨室（區） 沉降菌的測試方法
三、常見問題及解答
1、食品中大腸菌群的檢測有兩個標準三種方法，該如何選擇呢？
A：依據產品標準的項目單位
若單位為CFU/g，則選擇GB 4789.3-2016第二法（平板計數法）
若單位為MPN/g，則選擇GB 4789.3-2016第一法（MPN計數法）
若單位為MPN/100g，則選擇GB/T 4789.3-2003。
2、MPN法3個適宜的連續稀釋度該怎樣選擇？
A：依據產品標準的項目標準值
若標準值為＜3.0MPN/g，則選擇0.1g、0.01g、0.001g三個稀釋度。
若標準值為≤30MPN/100g，則選擇1g、0.1g、0.01g三個稀釋度。
四、樣品采集
怎樣采樣，才能使樣品具有代表性？ 這裏將樣品分為兩類：預包裝食品和散裝食品或現場製作食品
1、對於預包裝食品
① 應采集相同批次、獨立包裝、適量件數的食品樣品，每件樣品的采樣量應滿足微生物項目檢驗的要求。
② 獨立包裝小於、等於1000g的固態食品或小於、等於1000mL的液態食品，取相同批次的包裝。
③ 獨立包裝大於1000mL的液態食品，應在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達到均質後采集適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內作為一件食品樣品；大於1000g的固態食品，應用無菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內作為一件食品樣品。
2、對於散裝食品或現場製作食品
用無菌采樣工具從n個不同部位現場采集樣品，放入n個無菌采樣容器內作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應滿足微生物項目檢驗單位的要求。
五、培養基製備過程容易出現問題解答
1、異常現象一：培養基不凝固
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②低pH造成培養基酸解；
③稱量不正確；
④瓊脂未完全溶解；
⑤培養基成分未充分混勻。
2、異常現象二：pH不正確
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②水質不佳；
③外部化學物質汙染；
④測定pH時溫度不正確；
⑤pH計未正確校準；
⑥脫水培養基質量差。
3、異常現象三：顏色異常
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②水質不佳；
③pH不正確；
④外來汙染；
⑤脫水培養基質量差。
4、異常現象四：產生沉澱
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②水質不佳；
③脫水培養基質量差；
④pH計未正確控製。
5、異常現象五：培養基出現抑製/低的生長率
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②脫水培養基質量差；
③水質不佳；
④使用成分不正確，如：成分稱量不準，添加劑濃度不正確；
⑤製備容器或水中的有毒殘留物。
6、異常現象六：選擇性差
原因分析：
①製備過程中過度加熱；
②脫水培養基質量差；
③配方使用不對；
④添加成分的加入不正確，例如加入添加成分時培養基過熱或添加濃度錯誤；
⑤添加劑汙染。
7、異常現象七：汙染
原因分析：
①不適當的滅菌；
②無菌操作技術存在問題；
③添加劑汙染。
六、實驗過程
1、2016版平板法VRBA傾注完，待瓊脂凝固後為什麽需要加3-4mL的覆蓋層？
A：因為大腸菌群是需氧及兼性厭氧的，再加一層瓊脂相當於造就一個半厭氧環境，促進兼性厭氧菌的生長，同時抑製其他菌的生長。除此之外，還有防止菌落蔓延的作用，防止遷徙性菌落對菌落計數構成影響。例如一些變形杆菌就會有遷徙現象，從而導致菌落長成一片無法區分。在表麵多覆蓋一層培養基就可以避免這種情況的發生。
2、GB 4789.3-2016平板法驗證菌落如何挑取？
A：分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落數。按比例挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少於10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個，典型大腸菌群有6個。證實實驗應該按照可疑跟典型5:3的比例進行挑取，移種於BGLB肉湯管內。
七、結果處理
1、所有稀釋度都不在計數範圍內怎麽辦？
這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小於15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數乘以驗證試驗的比例來計算。例如10倍稀釋的兩個平板上菌落數分別為10、8，菌落數為10的平皿挑取10個菌落複發酵中有8個菌落產氣，菌落數為8的平皿挑取8個菌落複發酵中有7個菌落產氣，則計算過程是這樣的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、連續兩個稀釋度的四個平皿的菌落數都在計數範圍內怎麽辦？
這個需要參考菌落總數檢測國標裏7.1.2裏的公式計算。我們需要先計算每個平皿的驗證後的菌落數，再代入公式計算即可。例如10倍稀釋度兩個平皿菌落數為120和125,100倍稀釋度兩個平皿的菌落數為17和16，經過複發酵驗證產氣的管數分別為7、8、8、8，則我們先計算每個平皿上的菌落數分別為120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我們計14），16*8/10=12.8（我們計13），然後將84、100、14、13四個數代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結果應報告960CFU/g（mL）。
3、隻有一個稀釋度的一個平皿的菌落數在計數範圍，其他均不在計數範圍怎麽辦？
這樣我們隻需要複發酵驗證這一個平皿即可，根據這一個平皿的菌落數進行報告。例如10倍稀釋度兩個平皿菌落數為160和142,100倍稀釋度兩個平皿的菌落數為12和13，則我們隻需要從菌落數為142CFU的平皿裏挑取10個菌落進行複發酵驗證即可，假如共有7支發酵管陽性，則應計算142*7/10=99.4，結果報告99CFU/g（mL）。
本文轉載自微信公眾號實驗與分析。
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