隨機擴增DNA多態性分析

  隨機擴增DNA多態性分析(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)又稱為隨意引物PCR(Arbitrary Primed PCR, AP-PCR)是一種DNA指紋多態性分析技術，其理論依據是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點和數目可能不同，因而用一組人設計的核昔酸作為引物，通過PCR隨機擴增可產生物種 特異性的DNA帶譜。因此RAPD技術可用於細菌種間、亞種間乃至株間的親緣關係分析，未知菌株的快速鑒定和流行病學調查等。此外，RAPD的PCR產物還可作為探針，與Southern雜交技術結合，用於基因組或菌落雜交，可以填補基因組的遺傳圖譜和物理圖譜間的空缺。

  RAPD技術是1990年Williams和Welsh兩個實驗室分別建立的，Williams將通常PCR擴增中使用的特定序列引物巧妙地改為單一的僅由10個堿基的隨機序列引物；而Welsh則使用幾組通用引物，通過設置PCR擴增參數也達到了產生物種 特異性的DNA指紋圖。他們的研究賦予了RAPD顯著的優點：在對基因組序列一無所知的前提下即可分析其DNA的多態性；方法的簡單快捷和高度重複性可普及應用。

(一)方法一

  1.細菌基因組DNA製備

  以葡萄球菌(Staphylococcus)為例。菌株在2～5 ml的心腦浸液培養基中培養過夜，收集細胞並溶於0.2 ml的TE緩衝液；加入0.2 mg/ml的金葡溶菌酶,在37t保溫lh;加入0.2 ml蛋白酶K溶液（0.5mg/ml蛋白酶K,1% SOS,200 m mol/L EDTA,1 mmol/L CaCl2)，50℃保溫lh;澄清的上清用酚、氯仿抽提後用乙醇沉澱DNA;將DNA溶於TE中，並在瓊脂糖凝膠上電泳測定終濃度。

  2.PCR擴增引物

  引物I: Kpn-R: CCAAGTCGACATGGCACARTGTATACATAYGTAAC

  引物II: pBs: GGA.GGAAACAGCfATGACCATGA

  3.AP-PCR

  初級反應體係10μl: 0.025UTaqDNA聚合酶，Taq緩衝液(strata-gene)含4 mmol/LMgCh, 0.2 mmol/L各個dNTP,10 μ mol/LKpn-R引物或PBS引物，和DNA模板（濃度：30 pg-7.5 ng)。首先進行兩個低強度PCR循環：94℃, 5min; 40℃, 5 min; 72℃,5 min; 10高強度PCR循環：94℃,1 min; 60℃,1 min; 72℃,2 min;加入二級反應體係：2.25UTaq, Taq緩衝液，0.2 mmol/L各個dNTP和50μ Ciα- [32P] dCTP，繼續進行20-30個高強度PCR循環。

  4.聚丙烯酰氨凝膠電泳分離AP-PCR產物和放射自顯影

  PCR產物在5％的聚丙烯酰氨凝膠上電泳分離，1kb的標準分子量DNA作為對照，TBE作為電泳緩衝液。用Kodak XAR-5膠片進行放射自顯影。

(二)方法二

  1.DNA的純化

  同上

  2.引物設計

  引物設計遵照如下原則：①長度為9～10核甘酸；②G+C mol％範圍50- 80,③無回文結構。如：隨機引物0995: 5'CCGAGTCCA3';或隨機引物5'TGGTCAC'TGA3'。

  3.PCR擴增

  25 μl的反應體係：10 mmol/LTris-HCI (pHS.3); 50 mmol/LKCI;2mmol/LMgCl2; 0.01％明膠；100 μmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTIP; 0.2μmol/L引物；25ng基因組DNA; 0.5UTaq聚合酶。

    94℃, 1 min; 36℃, 1 min; 72℃, 2 min。

  4.PCR產物

  在1.4％瓊脂糖凝膠上電泳分離。

（三）影響AP-PCR的因素

  (1) PCR的退火溫度可能影響AP PCR帶譜的特異性和重複性，但其影響程度取決於引物的長度，引物長時影響不大可使用高退火溫度；引物短時影響大因而退火溫度要低 以保證引物與模板的結合。

  (2)模板濃度：DNA的模板濃度以30pg-7.5ng為適宜，lOpg是低限。

  (3)引物選擇：AP-PCR的引物不需特異選擇，尤其當用於種的鑒定時。但不同序列的引物擴增的PCR多態性不同，尤其是種或株特異性的DNA片段。

  本文節選自《常見細菌係統鑒定手冊》第十五章。

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