(一)熔解溫度(Tm)法
1.菌株培養和收集
（1）固體平板法：以菌懸液接種千平皿或克氏瓶的瓊脂培養基上，培養基和培養條件選其菌最合適的。一般24h（生長慢的菌可延長；芽孢菌應縮短，控製在生孢之前）後，用0.15 mol/LNaCl與0.1 mol/LEDTA (pH8.0)緩衝液洗平板，收集菌體。
（2）液體搖瓶法：接種斜麵種子於裝有液體培養基的三角瓶內，置200 r/min的搖床培養16-24h後離心。以上述同樣的緩衝液洗細胞，最終溶於同樣的緩衝液中，濃度為2～3g濕細胞125 ml緩衝液。
2.DNA提取和純化
（1）將上述培養液或細胞懸液離心收集細胞，並以TE緩衝液(10mmol/LTris-HCI；1m mol/LEDTA, pH8.0)洗細胞，懸浮於50m mol/LTris-HCI—5 m mol/L EDTA (pH 8.0)緩衝液中。
（2）加溶菌酶0.5-1 mg/ml（終濃度），置37℃水浴搖床30-60 min。
（3）加SDS(20%）至終濃度2%, 60℃水浴10 min或更長。
（4）加5 mol/LNaCI04至終濃度為1 mol/L。
（5）加等體積氯仿－異戊醇(24:1 v/v)，振蕩10 min。
（6）離心5000 r /min, 10 min。
（7）吸取含DNA的上清水層，加2倍體積乙醇(95%）。
（8）用玻璃棒卷出DNA絲。
（9）溶於0.1 SSC (0.1 SSC: 0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉）。
（10）重複5～9步驟2～3次，視樣品含蛋白質量而定。
（11）加終濃度為50 μg/ml的RNA酶，（RNA酶在0.15 mol/LNaCl (pH 5.0)中80攝氏度預處理10 min,以除DNA酶）置37℃水浴搖床30 min。
（12）加等體積氯仿－異戊醇搖10 min。
（13）離心5000 r/min, 5 min。
（14）吸取水相，加2倍體積乙醇(95%）。
（15）用玻璃棒卷出DNA絲。
（16）重複12-15直至無蛋白層。
（17）加1 ml 3mol/LNaAC-0.001 mol/L EDTA pH 7.0。
（18）邊攪邊加0.54倍體積的異丙醇。
（19）溶於O.lSSC。DNA純度檢查：O.D值230:260:280=0.454中0.515
3.Tm測定
（1）儀器：帶加溫裝置的紫外分光光度計。
（2）步驟：①心波長固定於260 nm；②將待測樣品用O.lSSC稀釋至OD260值於0.3～0.6間；③在波長260 nm首先記錄25℃飛的吸光度(A25 )然後溫度迅速上升至50℃；④每隔3～5℃記錄一次；⑤OD值開始上升表示變性開始，每隔l℃穩定5 min,記錄杯內溫度和OD值，直至OD值不變表示變性完畢。
4.Tm值計算
（1）熱變性溫度測定完成後，將記錄的溫度和相應光密度整理成表。
（2）含各光密度乘相應溫度的相對膨脹係數(Vt)與25℃時光密度相比Vt/V25,求得相對的光密度。
（3）以溫度為橫坐標，以相對光密度為縱坐標，繪製熱變性曲線。熱變性曲線中點相對應的溫度即為熔鏈溫度(Tm值）。
5.G+C mol％含量計算
0.1SSC:G+Cmol% =2.44Tm-69.3
1SSC:G+Cmol% =2.08Tm-106.4
注：必須以大腸埃希氏菌(E.coli K12)為參比操作對照，以核實實驗誤差。
（二）浮力密度法
在氯化銫(CsCI)中DNA的浮力密度（ρ）與它的G+C含量呈線性增長關係。當DNA分子在CsCl溶液中高速離心時，會在CsCl密度梯度形成的一定部位形成DNA帶。這個帶的DNA分子密度相當於這個部位的CsCl的密度，這個帶中點的DNA密度稱作為它的浮力密度(ρ)。
稱固體CsCl 6.3 g溶於合適的緩衝液(0.05mol/LTris-HCl pH 7.3)調整到最終重置為10g,即密度約1.700 g/cm 3,分別使1 ml C-sCl緩衝液含2-3 μgDNA和相同量 的標準DNA,重新調密度到1.700 g/cm 3,並用折射儀作簡單核算：1.700密度相當於折光指數1.3994。將溶液倒入10mm的單個分段杯放入離心機轉頭， 然後於分析超速離心機中逐漸加速至45,000 r/min, 25℃離心20h。利用DNA對紫外吸收來確定未知DNA密度帶的位置和標準DNA密度帶的位置，求得它們與離心機中心的距離(r和r0)。
利用公式：
ρ= ρo + 0. 0092 (r2-r20），ρ0為標準DNA密度(E.coli的ρo為1.710 g/cm3 )。根據Schildkraut公式， 求出待測DNA的G+C含量：
ρ= 1.66 + 0.098 (G+ C)
本文節選自《常見細菌係統鑒定手冊》第十五章。
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