有機酸測定

1.揮發性有機酸

  （1）標準溶液配製：（國產分析純）

   將上述溶液分別置於100 ml容量瓶中，加水至刻度，為1 mol/L標準母液，取母液稀釋100倍為10 mmol/L。

  （2）樣品預處理（酸化）：準備取1 ml的幼齡(24 h) PYG培養液， 以50%H₂S0₄,調pH至2，混勻，8000r/min離心1 min，同時有標準樣品混合物和空白PYG培養液同時酸化。

  （3）氣相色譜測定：用10 μl微量注射器取上述離心的上清液2μl用氣相色譜分析

   儀器型號：日本島津公司GC-TAG型氣相色譜儀C-R3A型自動積分記錄儀。

   檢測器：FID

   色譜柱：3mm X lm不鏽鋼柱

   色譜柱填料：GDX-401(60-80目）載氣及流速：高純氮50 ml/min

   氫氣壓力：0.6 kg/cm2

   空氣壓力：0.5 kg/cm2

   色譜柱溫度：220℃

   檢測器溫度：300℃

   記錄紙速：3mm/min

  （4）結果判斷：將待檢菌株的測定結果與標準溶液結果比較，根據各組分峰的保留時間以決定各峰的組分，並根據各組分峰的積分麵積計算其濃度，參閱VPI厭氧菌實驗室手冊分析標準菌株圖譜進一步識別。

2.非揮發性有機酸

  （1）標準溶液配製：

   將上述溶液移入同一個100ml容量瓶中，加少許蒸餾水待溶解後，再吸取丙酮酸0.72ml,乳酸1.35 ml置於上述的容量瓶中，再加蒸餾水至刻度。乳酸，草酸，丙二酸，丙酮酸，驍珀酸的濃度分別為0.1 mol/L，反丁烯二酸的濃度為0.05 mol/L。在進行氣相色譜分析時要像培養物一樣進行甲酯化。

  （2）樣品甲酯化①吸取1 ml培養液於5 ml比色管中；②加入0.4 ml50% H₂S0₄和2ml無水甲醇，蓋塞混勻，放60℃水浴30 min或室溫過夜；③測定前加入1 ml蒸餾水和0.5 ml氯仿，混勻，3000r/min,離心5 min。

  （3）氣相色譜測定：用10 μl微量注射器取管底氯仿層2μl進樣分析。

   儀器型號：日本島津公司GC-TAG型氣相色譜儀C-R3A型自動積分記錄儀。

   檢測器：FID

   色譜柱：3mm X 2m不鏽鋼柱

   色譜柱填料：GDX-401(60-80目）載氣及流速：高純氮30 ml/min

   氫氣壓力：0.6 kg/cm2空氣壓力：0.5kg/cm2色譜柱溫度：150'C檢測器溫度：250℃記錄紙速：3 mm/min

  （4）結果判斷；同揮發性有機酸。

   附：如果無氣相色譜儀的條件，測定有否乳酸，可用紙層析方法， 方法如下：

   乳酸測定

  (1)培養基：本試驗可結合測定乳酸細菌從葡萄糖產酸產氣試驗進行。 使用的培養基同前（見糖醇類發酵試驗）。將被測定的菌接種於液體培養基中，30℃培養3～5天，如果產酸，再做紙層析。

  (2)紙層析法：①展開劑：水：苯甲醇：正丁醇以1:5:5的量相混合，然後加1％的甲酸。②顯色劑：0.04％的溴酚藍乙醇溶液，用O.lN的NaOH調pH到6.7。

  采用國產新華濾紙或Whatman一號濾紙，依據樣品的多少，選擇一大小合適的濾紙，在紙張下方距邊約3cm處劃條橫線，每隔2.5-3 cm劃一點作為點樣位置，並注明點樣編號。在點樣的同時需要用2％的乳酸和不接種培養液二個樣品用為對照。

   將紙放入層析缸先用展開劑飽和已點樣的濾紙過夜，然後加展開劑開始層析。一般上行25cm即可。取出諒幹後噴顯色劑，觀察樣品上行是否出現有黃色斑點，並與對照比較其產生黃點的位置，以確定是否乳酸。

   本文節選自《常見細菌係統鑒定手冊》第十四章。

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